人肾脏近球小管上皮细胞培养和传代.pdfVIP

正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC ）的培养方法 拆装与贮存 1. 检查所有容器是否漏液或破损。 2. 对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。或者，解冻并立即 培养。 3. 对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养 箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2 ）中3 到4 个小时。细胞处于平衡状态后，除 去运送时的培养基并更新。 ® 4. Bulletkit 使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8 ℃下冷藏保存基础培养基， -20℃下冷冻保存SingleQuots®细胞生长因子。如送达后已经解冻，生长因子可在4 ℃下 冷藏，并需要在 72 小时之内加入基础培养基中。加入基础培养基后，在一个月之内使 用，不要再次冷冻。 TM 5. ReagentPack 传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。传代试剂在运送过程 中可能会解冻。可以进行一次再冷冻。如果在 3 天之内使用，可以在 4 ℃下冷藏。 Trypsin/EDTA 溶液的保存时间有限并会在4 ℃下活化。如果在送达之后出现解冻，立即 分装并在-20℃下冷冻。建议HEPES 缓冲液（以下简称HEPES ）和Trypsin 中和液不要 在4 ℃下冷藏超过一个月。 注意： 为保持解冻后的Trypsin/EDTA 的新鲜和活性，可将其按20ml 分装并置于消毒的离 心管中，-20℃下再次冻存。 培养基的制备 1. 用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。 2. 用移液管将全部的添加剂加入培养基中。 3. 用培养基冲洗添加剂管瓶。对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。少量的残存， 即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。 4. 将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。以此记录每种添加剂加入的时间 和含量。建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以 避免混淆和重复添加。 细胞解冻/起始培养 1. RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell ，肾脏近球小管上皮细胞) 的建议接种密度为 2 2500 cells/cm 。 2. 根据接种密度和培养皿的表面积确定培养皿的个数。在培养皿中加入适量的培养基 （0.2ml/cm2 ）并在培养前至少将培养皿放入培养箱中30 分钟。 3. 开启细胞冻存瓶前，先用乙醇或异丙醇消毒。在无菌区内，将瓶盖旋开约 1/4 圈以释放 压力，然后再旋紧。在37℃水浴中将细胞快速解冻，注意不要浸没整个冻存瓶。仔细注 意冻存瓶，当最后一片冰融化后将冻存瓶取出。解冻超过2 分钟会导致细胞功能无法达 到最佳状态。 4. 用移液管将冻存瓶中的细胞悬浮液分装至事先准备好的培养皿中。轻轻摇动培养皿使细 胞均匀分布，放回培养箱。 5. 不要用离心分离法移取冻存液中的细胞。该方法比培养皿中残存 DMSO 对细胞造成的 损伤更大。 传代 下述操作程序均针对25cm2 的培养皿。对于其它大小的培养皿需相应改变试剂用量。 第一份培养皿的传代准备： 1. 当细胞达到70-90%融合并呈现许多有丝分裂象的时候，即可进行传代。 2. 对于每25cm2 要进行传代的细胞： a. 解冻2ml Trypsin/EDTA 至室温。 b. 取7-10ml 的 HEPES 并达室温。 c. 取4ml Trypsin 中和液（TNS ）并达室温。 d. 取出培养基并达室温。 3. 准备新的细胞传代培养皿。 4. 一次进行一份培养皿的传代。接下来所有的培养皿将按照第一份的最优化条件进行传代 （细胞数，细胞成活率，接种密度）。 在无菌区内： 1. 从培养皿中抽去培养基。 2. 用5ml HEPES 冲洗细胞。不要遗漏该步骤。培养基中含有中和trypsin 的多种蛋白质及钙 离子。 3. 从培养皿