13生物化学实验--酶的专一性和影响酶活性的因素.docVIP

酶的专一性及影响酶活性的因素 【目的】 1 ．掌握 验证酶的专一性及温度、 pH 、激动剂和抑制剂对酶活性影响的实验方法。 2 ．熟悉 验证酶的专一性及温度、 pH 、激动剂和抑制剂对酶活性影响的实验原理。 3 ． 了解实验设计的对照原则。 【原理】 唾液淀粉酶只能催化淀粉水解，最终产物为麦芽糖，而不能催化其它糖如纤维素和蔗糖等水解。 蔗糖与淀粉均无还原性，与班氏试剂呈阴性反应，而麦芽糖和蔗糖的水解产物葡萄糖和果糖皆可与班氏试剂呈阳性反应，即在一定条件下使二价铜还原为一价铜生成砖红色沉淀。 淀粉水解程度不同，遇碘呈色反应不同，因此可以通过呈色反应了解淀粉水解的程度，从而判断唾液淀粉酶活力的大小。 淀粉水解及遇碘呈色反应如下： 【器材】 1 ． 恒温水浴 2 ． 电炉 3 ． 烧杯 4 ． 微量移液器 5 ． 试管 6 ． 漏斗 7 ． 量筒 8 ． 容量瓶 9 ． 冰浴 【试剂】 1 ． 1% 淀粉溶液 2 ． 1% 蔗糖溶液 3 ． 1% 氯化钠溶液 4 ． 1% 硫酸铜溶液 5 ． 1% 硫酸钠溶液 6 ． 1 ∶ 10 稀释的新鲜唾液 把铺适量棉花的漏斗放在小量筒上，收集过滤的唾液 2ml ，再用蒸馏水稀释唾液到 20ml 混匀备用。 7 ． 班氏（ Benedict ）试剂 称取柠檬酸钠 173g 及无水碳酸钠 100g 溶于 700 ml 蒸馏水中，加热促溶，冷却后慢慢倾入 17.3% 硫酸铜溶液 100ml ，边加边摇，再加蒸馏水至 1000ml ，混匀。如混浊可过滤取滤液备用，此试剂可长期保存。 8 ． I-KI 溶液 将碘 10g 及碘化钾 20g 溶于 100ml 蒸馏水中为贮存液，使用前稀释 10 倍。 9 ．不同 pH 缓冲液 取 28.40g Na 2 HPO 4 溶于少量蒸馏水 ， 移入 1 000ml 容量瓶内 ， 稀释至刻度为 A 液 ； 取 21.01g 柠檬酸溶于少量蒸馏水中 ， 移入 1 000ml 容量瓶内 ， 稀释至刻度为 B 液。 按下表分别吸取一定量的 A 液和 B 液，配置出所需的不同 pH 缓冲液。 pH A(ml) B(ml) 5.0 6.8 8.0 10.30 15.45 19.45 9.70 4.55 0.55 【操作】 （一）唾液淀粉酶的专一性 取 4 支试管，编号，按下表操作。 试剂（ ml ） 1 2 3 4 1% 淀粉溶液 1% 蔗糖溶液 稀释唾液 蒸馏水 1.0 — 1.0 — 1.0 — — 1.0 — 1.0 1.0 — — — 1.0 1.0 混匀， 37 ℃ ， 保温 8 分钟 班氏试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀，沸水浴，保温 2 分钟 观察记录颜色 ( 二 ) 温度对唾液淀粉酶活性的影响 取 5 支试管，编号，按下表操作。 试剂（ ml ） 1 2 3 4 5 1% 淀粉溶液 保温 5 分钟 稀释唾液 保温 8 分钟 保温 8 分钟 碘液 ( 滴 ) 2.0 37 ℃ 1.0 37 ℃ — 1 2.0 100 ℃ 1.0 100 ℃ — 1 2.0 100 ℃ 1.0 100 ℃ 37 ℃ 1 2.0 0 ℃ 1.0 0 ℃ — 1 2.0 0 ℃ 1.0 0 ℃ 37 ℃ 1 观察记录颜色 ( 三 ) pH 对唾液淀粉酶反应速度的影响 取 3 支试管，编号，按下表操作。 试剂（ ml ） 1 2 3 1% 淀粉溶液 缓冲液 稀释唾液 2.0 2.0 （ pH5.0 ） 1.0 2.0 2.0 （ pH6.8 ） 1.0 2.0 2.0 （ pH8.0 ） 1.0 混匀 ， 37 ℃ ，保温 5 分钟 碘液（滴） 2 2 2 观察记录颜色 ( 四 ) 激动剂和抑制剂对唾液淀粉酶的影响 取 4 支试管，编号，按下表 5 操作。 试剂（ ml ） 1 2 3 4 1% 淀粉溶液 1%NaCl 溶液 1%CuSO 4 溶液 1%Na 2 SO 4 溶液 蒸馏水 稀释唾液 1.0 0.1 — — — 0.5 1.0 — 0.1 — — 0.5 1.0 — — 0.1 — 0.5 1.0 — — — 0.1 0.5 混匀 ， 37 ℃ ，保温 3 分钟 碘液（滴） 1 1 1 1 观察记录颜色