微生物的诱变育种.ppt

4. 营养缺陷型的鉴定 (1) 鉴定方法 ① 一个平皿中加入一种营养物质以测定生长因子需求情况。 ②生长谱法：在同一平皿上测定许多种生长因子的需求情况。 (2) 营养缺陷型鉴定步骤 ① 缺陷型类别的测定 a: 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸 b: 酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均有 c: 维生素混合物，代表维生素类 d: 核酸碱基混合液或酵母核酸，代表嘌呤、嘧啶类 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选 ② 缺陷型所需生长因子的测定 4.1 营养缺陷型菌株的分离和筛选 (2) 营养缺陷型鉴定步骤 4. 营养缺陷型的鉴定 A－10 B－7 C－14 1. 生产实践中的应用 (1) 用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大量积累终产物的目的。 (2) 作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标 2. 基础理论研究中的应用 (1) 阐明微生物代谢途径 (2) 在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子等研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种。 4.2 营养缺陷型突变株的应用 第五节 温敏突变株的筛选 1. 概念：温敏突变株(temperature-sensitive mutant, TS突变株)是一类条件致死突变株： 在许可的温度下能正常生长，表型和野生型没有区别； 在非许可的温度下不能正常生长，表型和野生型不同。 2. TS突变株的形成原因： 主要由必需基因突变所导致的基因产物(如酶)的结构发生改变而引起的，即酶蛋白一级结构发生改变，而酶的活性中心并未发生变化。 有时非必需基因突变也可产生温敏突变株，但这类突变株在非许可温度下生长时，需要补充其他条件，如生长因子等。 3. TS突变株由许可温度转入非许可温度培养时，并不会立即停止生长繁殖，这是工业发酵所利用的重要生理生化特性。 5.1 温敏突变株的特性 1.温敏突变株的诱发 由于此类突变株主要由基因错义突变所致，所以使用诱变剂时，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线等诱变剂。 2. 富集 1. 抗生素法 2. 过滤或离心法 3. H3－前体法 5.2 温敏突变株的筛选方法 3. 分离筛选 1. 常规法 非必需基因突变温敏株：非许可温度，MM中不长，CM中生长。 必需基因突变的温敏株：非许可温度下，MM和CM中均不生长。 2. 特殊分离筛选方法 例：由甲醇和甘氨酸合成高产丝氨酸菌株的筛选： 首先筛选丝氨酸降解代谢障碍的TS突变株 然后排除C4二羧酸分解代谢障碍的TS突变株 5.2 温敏突变株的筛选方法 1. 温敏突变株在谷氨酸发酵中的应用 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用 2. 温敏突变株在丝氨酸发酵中的应用 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用 3. 微生物单细胞蛋白的生产 优良菌种筛选的要求： 富含蛋白质； 生长迅速，底物利用率高； 菌体细胞壁易破碎，容易自溶； 细胞蛋白质中的蛋氨酸含量高，提高单细胞蛋白质的营养价值 5.3 温敏突变株在发酵工业中的应用 第六节 抗噬菌体菌株的选育 噬菌体是寄生于微生物细胞内的一种病毒，其繁殖过程可分为：对寄主的吸附、侵入、增殖、成熟和裂解五个阶段。 1. 概念：短时间内能连续完成生活史五个阶 段而实现繁殖和裂解寄主的噬菌体。 2. 分离和效价测定方法 (1) 重层琼脂法 (2) 单层平板法 (3) 快速测定法 (4) 斑点试验法 6.1 烈性噬菌体及其效价的测定 1.温和噬菌体概念：侵入宿主后，噬菌体DNA只整合在宿主的染色体组上，并长期随宿主DNA的复制而复制，在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解。 2.溶源菌概念：核染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。 6.1 温和噬菌体及溶源菌 3. 溶源菌的显著特性： (1) 自发裂解：频率较低10－1～10－4。 (2) 诱导 (3) 复愈 (4) 免疫性 (5) 溶源转变 4. 溶源菌的检验方法 将少量溶源菌与大量敏感性指示菌混合后铺平板培养，可能产生中央有溶源菌的小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。 6.2 温和噬菌体及溶源菌 1. 专一性噬菌体获得和纯化：选择因子 2. 高效价噬菌体原液的制备 3. 噬菌体原液效价测定：重层琼脂法 4. 菌株诱发突变和分离 5. 液体摇瓶振荡培养 6. 进一步考查抗性菌株对周围环境中存在的各种噬菌体的抗性 6.3 抗噬菌体菌株的选育 1. 抗性菌株稳定性试验 菌株抗性产生的原因： 基因突变引起细胞结构改变，使噬菌体难以吸附和入侵； 细胞生理代谢的改变，即使噬菌体入侵，也不能在细胞内繁殖。 实际工作中，有时会把细胞的溶源性引起的免疫性误认为抗性 区分方法：采用诱变因子诱导菌株，如果是溶源菌将释放噬菌体。 2. 抗性菌株的产量