核酸探针检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的研究.pdfVIP

·184· 5T-全N璺医塑生塑兰量坐生垒堡堑塞 一]．999 RNA、 杂交拴测探针的敏感性． 啊探针时阳性重组质粘的I)NA、HCV I，PvDNA、PRVDNA的斑点杂交|盘测结果表明，探 I．8痛料来谢4头SPF仔猪45口龄时皋内^r VR2332株(TCIDSO为1(，‘)，感染剂量针对同源质粒DNA显不强阳性，而对HCVRNA、 感染ATCC PPVI)NA、PRVI．／IXA显示为为阴性}敏感性榆测表 勾2mI／头，实验设对照待l头．分驯于感染后30h、 7d、17d、28d宰杀．采取肺聃、肝脏．}卑脏、肾雠、脚隙、明，将仞浓度为25ng 扁挑体。脑、肺门淋巴结、眄系嚏淋巴结、膜股沟浅淋 的斑电杂交钻粜DI为阳性．1电明浚株针可检H{lpg 巴结、肩前淋巴结、睾丸、副睾、心壮、气管、鼻粘膜、 同源DNA州E’瘿该探”具有较高的敏感比、特异性。 、 胰腺、前列腺等组织．制备多聚甲醛吲定、6蜡包悼 的组织切片．4头鼻内人工感染PRRSV北京分离昧 B96—4的褚，接感染剂量及宰杀时闻同L；4例此抬 于二送检后5h内取材固定，两者所取组织为肿啦、旰 蛀、脾|I庄、肾睚、胸腺、扁桃体、临、帅门r林巴结、肩前 淋巴结艘腹股沟浅淋巴结，制备多泉甲醛固定、石蜡 包埋的组织切片。 I．9厚位杂交格Lh、1)将臼1片脱蜡入水后晾f。cZ 啊片经02mol／1。HCI处理10min后绝DEPC水及冒 PBS各洗涤1IX：。t’t用20mmo]／I．Tris·ftCI柙2m图1克隆质粒的EcoRl酶切分析 XDNA／EcoRI+ mol／I．CaCl 1蓝斑匝粒DNA：2白盥质粒DN．、；3 2(pH74)37{作用衄『片1·Jmln。j)崩 HindⅢ；4白搿质粒DNA 7(怍．ifl切片30min．誊一 10／。g／ml的蚩白酶K溶液3 刘苣：}}【质粒I)NA进行的RFIt’分析表明，插入 ”．2％甘氩酸作片j切片5rain终lh蛋白酶K的作用， ORF 的外源片段即为PRRSV6的c1)NA，且外源片 掉用PBS洗涤2次．@用含j(1}7主：离广甲酰舨、：× 段是绎反向插入栽体。 SSC、2蟛封闭矿．存披、0．02％SDS、lI)0#g／ml女#白精 2．3 A1CCVR一2332人工感是5PF掊体内晌喃垂 DNA的预杂交液42 c作用lh。⑦用含j{}峨去离子 甲酰胺、5×SSC、10“硫酸葡聚糖、2％划吲贮存液、 分而 AICCVR2332人T感缨SPF猪体内的病 毒分布见丧1。 0．02必SDS、100ltg／rnl鲑鱼精I)NA厦3ng／一的杂 交液42C杂交20h，M时段不加探针的}埘H：时照。叠 人工感染后30h，t,li可在毗肚、肾呲、脾畦、刖：脏、 切片经2×SSC，60％甲哦胺52c洗澡2次，每次 心啦、扁桃体、啊隙、肺门淋巴}}、肩前淋巴结、腑、鼻 5rain。再绛0．1×SSC窀温洗涤2次．每次lgmin． 特蟆、肇丸中枯出病毒阳性杂交信号。并且在脾脏、 然后援Dig杯|己及检测试剂盒提供虻方法进