基因组DNA测序文库构建.docVIP

基因组DNA测序文库构建 对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。 对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。 对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 用Qubit检测DNA样品浓度。 吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 修平和磷酸化 100ul体系 DNA ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm） 1ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul） 1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul） 1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul lib-PCR-R 0.5ul tagE 0.5ul DNA 5ul ddH2O 33.5ul 琼脂糖胶回收。 Qubit测值，总量足够的情况下，取3ul跑胶检测。 附录 T4?DNA?Polymerase由于同时具有5→3DNA聚合酶活性和3→5DNA外切酶活性，可以用于将5端突出末端补平或3端突出末端削平。T4?DNA ?Polymerase的3→5DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4?DNA?Polymerase所消化。T4?DNA?Polymerase的3→5外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 片段) 是 E. coli DNA 聚合酶 I 的蛋白水解产物，具有 DNA 聚合酶活性和 3 →5 核酸外切酶活性，但缺失了 5 →3 核酸外切酶活性。Klenow 既保留了全酶的高保真性，又不会降解 DNA 5 末端由于该酶具有 3 →5 核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、未加入 dNTP 或反应时间过长均会导致 DNA 末端碱基被切除形成凹陷 T4 多聚核苷酸激酶能够催化磷酸在 ATP 的 γ-位和寡核苷酸链 (双链或单链 DNA 或 RNA) 的 5-羟基末端以及 3-单磷酸核苷间进行转移和交换1 个 Richardson 单位，指 37条件下，30