优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究.pdfVIP

第 25 卷第 2 期 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 Vol.25,No.2 2009 年 3 月 Journal of Qiqihar University March,2009 优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究 1 2 1 王世伟 ，李旭业 ，张伟伟 （1. 齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005） 摘要：通过研究不同生长状态、处理溶液、保存时间及热激时间对感受态细胞制备的影响，分析了影响大肠杆菌 株JM109和DH5α感受态细胞形成因素，优化了制备感受态细胞的方法。结果表明，OD600为0.43的大肠杆菌菌液 经处理液（20 mmol/L MgCl + 80 mmol/L CaCl ）处理，-85℃放置12～14 h，42℃热激处理90 s，转化效率最高， 2 2 5 5 可达5.5×10 ～6×10 cfu/µg DNA（pSilencer2.1-U6-neo），随着质粒放置时间增加，转化效率下降。 关键词：感受态细胞；制备方法；转化效率 中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1007-984X(2009)02-0086-05 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli ）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[1] ，是基因克隆以及 DNA 文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而 利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便、应用广泛，但是氯化钙法在实际操作中的转化效 率常常不能完全满足试验的要求。目前，实验室中常用的感受态细胞多为公司直接提供的，其价格昂贵， 不适于普通基因克隆操作中的频繁使用[2，3] 。因此，对感受态细胞制备方法进行合理优化是提高转化效率 的关键。 1 材料与方法 1.1 菌种与质粒 DH5 α由齐齐哈尔大学分子生物学实验室保存，含 pSilencer2.1-U6-neo 大肠杆菌（Escherichia coli ） 质粒；大肠杆菌 JM109 由黑龙江大学分子生物学实验室赠送。 1.2 培养基和试剂配制 1.2.1 LB 培养基 1） LB 液体培养基配方见表 1。 表 1 LB 液体培养基配方 2）含 Amp 的 LB 液体培养基：根据表 1 制备 50 ml 的培 -1