下调hENT1可抑制胰腺癌细胞株SW1990对gemcitabine跨膜转运.pdfVIP

下调hENT1 可抑制胰腺癌细胞株SW1990 对 gemcitabine 的跨膜转运1 1 1 2 2 1 张红刚 ，徐建敏 ，费晓庆 ，鞠煌先 ，刘胜利 1东南大学医学院附属中大医院，南京（210009 ） 2南京大学化学化工学院，南京（210009 ） E-mail ：lsl88408@163.com 摘 要：目的: 明确下调hENT1后对胰腺癌细胞株SW1990跨膜转运gemcitabine的影响。方 法 将能特异性下调hENT1 的pSilence-hENT1 4.1-CMV neo 的重组质粒以及对照质粒转染到 胰腺癌SW1990细胞内。采用G418 筛选阳性克隆细胞，RT-PCR 检测hENT1 mRNA表达情况。 培养SW1990细胞、pSilence-hENT1Si-SW1990 、pSilence-Control-SW1990 细胞，三组细胞培 养基中均含gemcitabine 100 µg/ml ，温育0 ，15，30 min ，1，2 ，4 h 后收集细胞。取等量细 胞悬液2份各100 µl，一份作为检测样本用毛细管区带电泳测定gemcitabine总量，另一份用作 平行样本测定总蛋白含量。根据蛋白—— 细胞数量标准曲线来确定平行样本中细胞数，再用 血细胞分析仪确定细胞体积，最后，计算单细胞内药物总量及浓度。结果 pSilence-hENT1Si-SW1990 细胞的hENT1 mRNA 表达水平下调50% 。SW1990 组用含 gemcitabine (100 µg/ml)的DMEM培养基温育后，细胞内药物浓度在30 min达55.1 µg/ml±10.4 µg/ml，60 min达70.2 µg/ml±7.8 µg/ml ，120 min后处于平台期 (90.1 µg/ml±6.0 µg/ml) 。相比 之下，pSilence-hENT1Si-SW1990组细胞内药物浓度30 min达41.3 µg/ml±4.9 µg/ml ，60 min达 平台期 (51.3 µg/ml±11.8 µg/ml) ，与对照组相比，细胞内浓度处于较低水平 (p 0.05) 。 pSilence-hENT1control-SW1990组与SW1990组相比差异无统计学意义 (p 0.05)。结论：下 调hENT1可以抑制胰腺癌细胞株SW1990对gemcitabine的摄取，hENT1是gemcitabine跨膜转 运的主要通道。 关键词：RNA干扰，核苷载体，gemcitabine ，毛细管区带电泳，胰腺癌细胞株 Gemcitabine是临床上胰腺癌化疗的一线核苷类药物，具有亲水性，不易透过细胞膜， 因此需要借助核苷载体 (Nucleoside Transporters, NTs)进入胰腺癌细胞 [1] 。许多学者通过对 胰腺癌细胞hENT1表达水平与gemcitabine化疗效果的研究发现，平衡型核苷载体hENT1是转 运gemcitabine 的主要通道，胰腺癌细胞hENT1表达水平与对gemcitabine敏感度呈正相关[2-7] 。 然而，目前尚缺乏更直接的证据来支撑这一结论，如gemcitabine是如何通过hENT1进行转运， 干扰或敲除胰腺癌细胞hENT1后对细胞摄取gemcitabine 的能力有何影响等仍需要进一步研 究。为此，本文将采用RNAi 技术下调胰腺癌细胞hENT1 表达，直接验证hENT1 是否为 gemcitabine进入细胞的主要通路。 1. 材料和方法 1.1 仪器与试剂 所使用的化学试剂均为分析纯。gemcitabine (批号061102) 由豪森制药有限公司赠送， BCA 试剂盒 (批购自碧云天公司，RIPA试剂盒 (批号061102)购自上海申能博彩 生物科技有限公司，乙腈及二水磷酸二氢钠购自上海凌峰化学试剂公司，小牛血清 (批号 060611)购自杭州四季青公司，青霉素、链霉素购自