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第五章 免疫化学法 §1.前言 §1 前言 免疫化学法的发展概况： §2.免化法的方法原理及特点 抗原决定簇（antigenic determinant ） 是存在于抗原分子表面，决定抗原特异性的特殊化学基团，一般由5～8个氨基酸残基、短寡糖残基、核苷酸残基组成。抗原决定簇是被免疫细胞和抗体分子识别的标志，是免疫反应具有特异性的物质基础。 交叉反应示意图 1.4 免化法测定原理 1.5 具体测定的方法 2 方法特点 2.1 灵敏度极高 最低检测浓度达10-9~10-12g/ml水平。 原因： ① 选用对药物具高度亲和性的抗体用结合蛋白使含量极低的药物被抗体牢固结合，易于检出。 ② 引入了能够提供强检测信号的标记物，如：放射性同位素标记,荧光标记，酶标记等，并采用高灵敏的理化手段检测。 2.2 特异性（选择性）较高 2.3 所需样品量少，且样品前处理过程 简单，常常不需要任何前处理。 §3.抗体的制备及其质量评价 1.抗体的制备 2.抗体质量的评价 1.抗体的制备 标记物 三种基本试剂 抗体 药物标准品（非标记物） 抗体质量的好坏直接影响到测定结果的灵敏 度和精密度。 1.1 从药物半抗原制备抗原 半抗原（hapten）：分子量小于1000的物质，需要与蛋白质或多肽等载体物质结合后，才能具有抗原性，并诱发特异性抗体。这类小分子物质称为半抗原。（临床上使用的药物大多数为半抗原） 从药物半抗原制备抗原的两个主要问题： ① 载体的选择 关键： 应使药物与载体形成的结合物易溶解。 最常用的载体： 牛血清白蛋白(BSA)；兔血清白蛋白(RSA) ② 药物与蛋白质载体的结合 包括： a.结合位点 b.结合方式 c.每个蛋白分子所结合的药物分子数目 a.结合位点 b.结合方式 c.每个蛋白分子所结合的半抗原分子数目 1.2 抗体的获得 将经纯化、冻干的药物——载体蛋白结合物悬混于弗氏完全佐剂 （Freund’s complete adjuvant）中，配成1mg/ml的混悬液，用皮下或皮内注射的方式注入免疫动物体内（常用家兔、山羊、豚鼠），（也可采用股淋巴结直接注射），数月后可诱发得到所需抗体。当免疫动物血液中抗体达到一定量后，及时采血，分离血清（或血浆）。便可获得能对特定药物专一性结合的特异性抗体。 2.抗体质量的评价 从三个方面进行评价: 2.1 特异性（specificity） 2.2 亲和力（affinity） 2.3 滴度 （titer） 2.1 特异性 （specificity） ①抗体与标记及非标记药物的结合能力 （要求：对标记及非标记药物有同等结合力，以便有效抑制） ②抗体与同特定抗原相似物质的结合能力，即交叉反应的程度 （要求：抗体与标记药物的结合力不被交叉反应所抑制） 2.2 亲和力（affinity） 用抗原抗体反应常数K表示： K=[Ag-Ab]/[Ag][Ab] 2.3 滴度（titer） 小 结 §1.前言 四大标记免疫技术 §4.放射免疫分析法 1 免疫化学法的分类 2 放射免疫分析（RIA）定义 3 RIA中的基本问题 4 具体操作步骤 5 RIA的优缺点 2 放射免疫分析（RIA）定义 3 RIA中的基本问题 3.1 抗体的制备 3.2 标记药物的制备 3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离 3.4 放射性强度测定 3.5 标准曲线的绘制及样品测定 3.2 标记药物的制备 a．对同位素的要求 b．RIA中常用的放射性同位素 3H，14C，125I，131I, 75Se等 (其中3H 和125I应用最多，且以125I应用最广泛)。 125I标记药物的常用方法：氧化法 常用氧化剂有H2O2，ICL，氯胺T 3.3 结合标记药物与游离标记药物的分离 RIA属非均相免疫分析，须将游离标记物与结合态标记物分离后才能测定各自的放射性强度。 *双抗体法 固相法 吸附法 化学试剂沉淀法 双抗体法 （double antibody method） 3