生物工程下游技术第八章_非线性色谱原理.pptVIP

非线性色谱的3种展开方式 3.置换展开：在样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的流动相通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。 优点：溶质浓度不降低，还可以起浓缩作用。 缺点：置换剂不好找；合适的固定相和流动相的取得不容易。 第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用 1、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography * 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 ～ 30cm），一次制备量０.1～１mg；  2.制备HPLC概述—主要结构单元 输液部:输液泵 shimadzu LC-6AD(适用于分析-半制备,再循环半制备) 分离部:制备柱 　　内径20～50mm，柱长50cm。 检测部:检测器 shimadzu SPD-M10Avp 馏分部:馏分收集器 shimadzu FRC-10A 色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大 进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。 制备HPLC概述—柱容量  制备HPLC概述—制备HPLC与 分析HPLＣ比较 目的 填料 流量 流通池 联系 制备HPLC 样品中特定成分的高纯度获取，大量、廉价的制备 20μ以上为佳 0.1-150ml/min 最大允许流速可为150mL/min 在进行制备HPLC之前，常先进行分析HPLC实验，对分析方法进行优化、放大应用到制备HPLC中。 分析HPLC 定性分析： 检测的灵敏度 定量分析：分离度、再现性 3-5μ 0.001-9.999ml/min 一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min，或者10mL/min 3. 制备型液相色谱仪 * 制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。 基本概念 Cs=KCm 线性色谱:流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)呈线性关系. 非线性色谱:Cm与Cs不存在线性关系的色谱. 分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱 固定相 流定相 对应塔板界面 Vs Cs Vm Cm 非线性色谱的特点 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化; 峰形的不对称性:不是高斯正态分布; 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降. 非线性色谱理论基础 研究对象：样品在固定相和流动相中的浓度处于非线性关系下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系。 首先要了解Cs与Cm之间的函数关系，也即要研究吸附等温线及相应的吸附模型 吸附等温线：一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。 分类：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形 凹形 线形 Cs Sig tR 峰形 tR m 图8. 分布等温线类型及对色谱峰形和保留时间的影响 通常出现于大多数小分子化合物 它反映了溶质分子在固体表面达到饱和时生成了单分子吸附层，随着溶质浓度的增加，吸附等温线的曲率逐渐减小，最后为零即达到饱和态。 “拖尾” H型等温线 是凸形等温线的特殊状态，它代表了一类很容易在固体表面吸附的物质，而且很容易达到饱和，这类吸附主要是一些分子量大的聚合物，如聚乙烯、聚苯乙烯 凹形吸附等温线是适用于在低浓度下已吸附的被吸附分子又能吸附在液相中的分子，从而生成多分子吸附层的那些物质，所以这种吸附等温线的曲率随浓度的增加而增加。 S形等温线实际上是凸形与凹形两种等温线叠加的产物，它代表了被吸附的分子之间具有很强的作用力，能进一步吸附其他分子，而溶质分子与固相表面的作用力相对较弱，或者与表面覆盖率无关。 ？问题：各种类型等温线代表的溶质在两相间具哪些分配特性？ ？问题：从吸附等温线能提供哪些非线性色谱性质的信息？ 吸附等温线可以提供以下信息： 预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状； 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件； 反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。 建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。 吸附等温线的测定 A、静态测量法 q与C之间的关系（q：溶质在吸附剂上的浓度；C：溶液浓度）： q=ΔC.V/G （V为溶液体积，G为吸附剂量） 优点：方便简单，不需要特殊