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年度计划执行情况 在973项目（项目代号2011CB910800）的资助下，2011年本子课题“重要代谢调节因子的结构基础和调节机制”在研究AMPK蛋白的分子调控机制及AMPK与Wnt和TGFbeta信号通路之间的相互关系中获得了重要进展，同时对TGFbeta信号通路中的E3连接酶Smurf1的分子机制也进行了深入的研究，在FEBS Letters杂志发表论文1篇。 AMPK（AMP-activated protein kinase）是调节细胞能量代谢的关键枢纽，其活性受体内AMP/ATP比例的调控，因此对于糖脂代谢稳态的调控起着重要的作用。AMP激活AMPK的途径现在一般被认为至少包含了两个方面，一方面AMP与(亚基的结合可以对AMPK进行别构调控，另一方面AMP的结合还会减弱AMPK的去磷酸化负调控。为了揭示AMPK的活力调控机制，许多实验室都进行了AMPK的结构生物学研究，近年来陆续在Nature、Science等学术刊物上发表了一些关于其各个亚基间结合方式的论文，2011年又有实验小组报道了活化的AMPK激酶结构域与核心结构域的晶体结构，对AMPK在被去磷酸化过程中受AMP保护的现象给出了初步的解答。但是，已有的工作还是不能对于AMP究竟如何调节AMPK活性这一个关键问题做出解答，因为从已有的结构信息来看，AMPK的(亚基在结合不同核苷酸时，其三维结构没有明显变化。我们对已报道的实验结果进行了详细的分析，发现蛋白晶体的获取方法（浸泡置换）可能会导致带偏差的实验结果。因此，我们尝试了不同组合的AMPK核心结构域蛋白，并将其与AMP或ATP分子进行共结晶。最终我们得到了核心结构域与AMP或ATP分子的复合物的晶体结构，分辨率分别为2.5埃和2.6埃，并发现在结合不同核苷酸的两种状态下，AMPK核心结构域上(亚基的部分区域具有显著的构象变化（图1）。 图1 AMPK核心结构域结合不同核苷酸的晶体结构 （a）AMPK的结构域示意图； （b）AMPK核心结构域与ATP的复合物晶体结构； （c）AMPK核心结构域与AMP的复合物晶体结构。 借助蛋白质三维结构所给出的启示，我们制备了一系列全酶的突变体蛋白，一方面利用HPLC的方法分析其核苷酸结合状态，另一方面测定了这些蛋白的活力状态及其活力是否受核苷酸调控的影响。综合这些结构信息和生化实验结果，我们鉴定出了AMPK(亚基上真正的别构调节位点，并通过分子模拟的方法，进一步证明了该位点在结合不同核苷酸的状态下，构象具有显著的变化（图2）。由此我们提出了一个AMPK活力调控机制的新模型，其中，(亚基上的几个核苷酸结合位点对于不同的核苷酸具有不同的亲和力，并且不同核苷酸的结合将导致(亚基上特定区域的结构发生显著的变化，从而影响到(亚基的激酶结构域上，调控了AMPK的活力。相关的论文已经投出，正在论文送审阶段。 图2 AMPK核心结构域在结合不同核苷酸时的构象变化 如图所示，AMPK在结合不同核苷酸时，其(亚基的螺旋(10附近会发生显著的构象变化：蓝色：位点4结合ATP；粉色：位点4结合AMP，位点3结合ATP；绿色，位点4和位点3均结合AMP。 另外，从我们解析的不同核苷酸结合状态的核心结构域结构出发，我们还深入研究了AMPK的(亚基在结合ATP或者AMP时，是如何将构象变化传递到(亚基的激酶结构域上并影响AMPK活力这个问题。我们首先通过NMR和蛋白质晶体两种手段，分别证实了哺乳动物AMPK的自抑制结构域（位于(亚基上的激酶结构域后面的一段序列）与我们之前所报道的酵母AMPK同源蛋白的结构与调控方式是类似的。然后我们仔细分析了已有的活化AMPK激酶结构域与核心结构域的晶体结构，认为(亚基上自抑制结构域后的一段序列可能参与了(亚基所引发的别构效应的传递，因此我们制备了一系列AMPK突变体蛋白，一方面测定它们是否受AMP别构激活，另一方面测定它们的去磷酸化是否受AMP保护，由此来验证这段区域是否负责别构效应的传递。现在已有的实验结果初步证实了我们的模型，还在进一步的验证当中。 此外，在AMPK与Wnt信号通路及其它信号通路的交互关系的研究中，我们发现AMPK对Wnt信号通路的影响较为复杂，同时与TGFbeta信号通路似乎也有一定的关系。我们发现AMPK可以与Wnt信号通路和TGFbeta信号通路中的调控因子相互结合，目前正在检测AMPK的结合是否会影响这些调节因子的磷酸化状态。 项目执行过程中存在的问题及其对策。 获得AMPK全酶晶体结构一直是我们研究工作的核心目标之一，但是由于AMPK是一个超过100KD的复合物，即使我们将一些比较柔性的区域进行截断，剩下的三聚体复合物分子量也较高，这给结晶带来了很多挑战；况且各种结构域的组合中有大部分的蛋白都呈现不表达或不可溶的状态，也减少了我们进行晶