T细胞受体δ2链互补决定区（CDR）3与抗原结合的分子结构基础—一个利用细胞膜表达不同CDR3δ移植型TCRγδ技术的的研究例证.pdf

北京协和医学院博士研究生论文 T细胞受体62链互补决定区(CDR)3 与抗原结合的分子结构基础 一一个利用细胞膜表达不同CDR36移植型TCR丫6技术的研究例证 (中文摘要) 博士研究生：郗雪艳 导师：何维教授、崔莲仙教授 晚近，固有免疫中的细胞成分一Y6T细胞在抗感染免疫、肿瘤免疫、免疫调节以 及自身免疫等方面的重要作用广受关注。然而，与承担特异性细胞免疫功能、MHC 一抗原肽一TCR0【p三元体结构解析较为清楚的仅pT细胞形成鲜明对比的是，免疫学 术界对丫6T细胞受体(TCI郴)识别抗原的结构基础所知甚少，同时TCR丫6所识别的 抗原鉴定工作也进展缓慢。 在CDR3合成多肽、CDR3移植性Ig与肿瘤靶细胞、靶组织以及肿瘤细胞提取蛋白 6是TCR62链与抗原结合的关键 的相互作用机制方面做了大量的工作，验证了CDR3 部位。为了更真实地反应TCR丫6的结合活性，本研究中，我们通过TCR丫6重建技术， 构建了一个利用细胞膜表达不同CDR36移植型TCR丫6异质二聚体的技术体系，来研 究CDR36与抗原特异性结合的分子结构基础。另一方面，该技术体系也为寻找Y6T 细胞的抗原表位提供新的方法。 本文的主要工作及学术成果如下： 一、CDR36与抗原结合的分子结构基础 4 !!室塑塑堕兰堕堕圭里窒生笙奎 1．构建了CDR3区移植型TCRY6转染细胞系 细胞系能够模拟丫6T细胞特异性识别抗原。 2．TCR丫6识别抗原的关键部位是CDR36 种肿瘤细胞也具有细胞毒作用，杀伤活性也能被抗TCI郴的单克隆抗体所阻断。另外， 瘤抗原的反应性高于无关CDR3序列对照转染细胞(即两种细胞表达的TCR具有相 能够模拟丫6T细胞特异性识别肿瘤细胞抗原，并且TCR丫6识别抗原的过程中CDR36 起着关键的作用。 3．CDR36的侧翼序列是抗原结合特异性的关键决定簇 为了进一步探讨CDIU6与配体作用的分子结构基础，我们将OT3的V、D和J 区突变体相对应的核甘酸序列嵌入到完整的62链中，与相同的丫9链共转染，构建各 胞。在丫6TCR表达率相同的前提下，比较各个转染细胞与肿瘤细胞的反应性。结果显 白及HSP70、11MSH2 活性降低不明显。这一结果与我们实验室前期用OT3突变肽检测与肿瘤细胞的结合 北京协和医学院博士研究生论文 结合。 4．CDR3697位的疏水性氨基酸在识别非肽抗原和蛋白抗原方面的差异 方法将697的异亮氨酸(I)突变成同样疏水性氨基酸亮氨酸(L)以及酸性氨基酸天 冬氨酸(D)和羟基类氨基酸丝氨酸(S)后，这些突变体转染细胞在非肽抗原刺激 作用后IL．2的表达量有所差异。突变成亮氨酸后，IL．2的表达量下降不明显，而突 变成另外两种氨基酸后，其IL．2的表达量降低明显或几乎没有。实验结果进一步说 明697位置的疏水性氨基酸对于非肽抗原的识别至关重要。但是，697位的氨基酸突 酸在识别非肽抗原和蛋白抗原方面存在差异。 二、以OT3丫6TCR细胞系为探针，利用差异筛选的方法在噬菌体随机展示肽库中 进行抗原表位筛选 以OT3Y6TCR细胞作为探针，用差异筛选的方法，在噬菌体十二肽库中，筛选 TClⅥ6特异结合的十二肽，得到了两条优势序列。人工合成的优势十二肽的结合特性 分析与体外功能实验，证明这两条十二肽都可为OT3Y6TCR所识别，提示可能是其 抗原表位。这一实验结果证明我们的策略是可行的。 本研究通过结构生物学手段进一步验证了CDR36在抗原结合中所起的关键作 用，即CDR36决定抗原结合的特异性。我们所取得重要创新性科学发现为，首次发 序列在结构上是呈现的保守特点，故在理论上推测其CDR36侧翼序列只能与结构同 样保守的蛋白多肽序列结合。在此意义上说，TCIⅥ6所识别的配体是结构保守和数量 有限的。因此，这一发现为TCI郴识别抗原的有限多样性提供了强有力的结构生物学 证据。