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葡萄糖浓度的测定 实验目的及要求 掌握邻甲苯胺法法测定葡萄糖含量的原理和方法。 学会取液器及紫外分光光度计的使用。 了解葡萄糖浓度测定的意义。 实验仪器及试剂 772型分光光度计；试管；移液管；水浴锅。 邻甲苯胺试剂：硫脲2.5g，邻甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸溶解，在1000ml容量瓶内调至到刻度。 葡萄糖标准贮存液：10mg/ml。 葡萄糖浓度测定的意义 正常人血糖浓度在神经和激素调节下维持相对恒定。当调节因素失去平衡时出现高血糖或低血糖。 病理性高血糖见于胰岛α-细胞瘤等疾病。 病理性低血糖见于胰岛β-细胞瘤、垂体机能减退、肾上腺皮质机能减退、甲状腺机能减退、及肝坏死、糖原累积症等疾病。 测定葡萄糖浓度的方法 Folin-吴宪法： 利用葡萄糖的还原性，在与碱性铜试剂共热时，是铜离子还原成亚铜离子。 邻甲苯胺法：利用醛糖在热醋酸溶液中与苯胺类缩合生成青色的Schiff碱。 葡萄糖氧化酶法 ：利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖的氧化作用。 Folin-吴宪法历史 中国旅美生化和分子生物学家吴宪在美国哈佛大学Otto Folin教授指导下，完成了题为“一个血液分析系统”的博士论文； Folin与吴宪建立的无蛋白血滤液制备，血糖、非蛋白氮、尿素、肌酐、肌酸等测定方法，奠定了血液化学分析的基础 ； 其中以“Folin－吴宪法”著称，在1920到1950年间用于世界上许多病人的诊断和治疗的追踪。 Folin-吴宪法原理 葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的Cu2+还原为黄色的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为羧基。 氧化亚铜可使磷钼酸还原成蓝色的钼蓝，蓝色的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定钼蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。 葡萄糖氧化酶法原理 醌亚胺在480-550nm范围内有最大吸收峰，且醌亚胺的量与葡萄糖的量成正比，利用比色法测定醌亚胺的量即可计算出血糖的含量。 邻甲苯胺法原理 葡萄糖在热醋酸溶液中脱水后与邻甲苯胺缩合，生成青色的Schiff碱，其颜色深浅与葡萄糖含量成正比，其反应式如下： 葡萄糖标准溶液制备 取10ml容量瓶6只，分别编号①、②、③、④、⑤ ； 依次加入葡萄糖标准贮存液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml； 以H2O稀释至10ml，混匀以上葡萄糖标准液浓度分别为50、100、200、300、400mg/100ml。 实验步骤 实验步骤 混匀后置沸水浴中煮沸15分钟，取出置冷水中冷却。 用分光光度计在波长630nm处进行比色，以“1”管作空白校零，读取各管吸光度。 数据处理 以吸光度为纵坐标，相应管中的葡萄糖浓度为横坐标，以样品 “2” “3” “4” “5” “6”为基础在坐标纸上绘制标准曲线。 根据测定管的吸光度，查标准曲线，得到未知样品中的葡萄糖浓度。 实验注意事项 测定血糖必须采用空腹血。若用抗凝血最好采用氟化钠抗凝剂。 邻甲苯胺法，试剂酸度很大，操作过程需谨慎。 取加热试管时务必当心烫伤。 思考题 * * 考试 Otto Folin Hsien Wu 0 0.1⑤ 5.0 6 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 邻甲苯胺试剂（ml） 0.1 0.1④ 0.1③ 0.1② 0.1① 0 样品 （ml） 0 0 0 0 0 0.1 蒸馏水（ml） 测定管 5 4 3 2 1 样品 试剂