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pcr引物设计原则.ppt
PCR引物设计软件 primer Premier 5.0 应用简介 温州医学院附属第一医院检验科 陶志华 一. 引物设计的基本原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) ΔG值(internal stability) 引物二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition） 1. 引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度 2. 引物3’端的序列 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 3. 引物的GC含量 一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4. 引物所对应模板序列的Tm值 最好在72℃左右 5. ΔG值(自由能) ， 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低 6. 引物二聚体及发夹结构的能量 一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行 二. Primer Premier 5.0 引物设计软件简介 Primer Premier 5.0用途： 引物分析评价功能； 引物的自动搜索功能 Premier的主要功能： * *
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