碳酸酐酶在硅藻土上的固定化及其性质研究.pdfVIP

碳酸酐酶在硅藻土上的固定化及其性质研究／高伟芳等 ·405 · 碳酸酐酶在硅藻土上的固定化及其性质研究 高伟芳，肖 翔 ，张朝晖 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310014 摘要 以硅藻土为载体 ，通过共价结合法 固定化碳酸酐酶。对制备固定化酶过程 中的pH值、加酶量 、反 应温度 、反应时间几个重要的影响因素进行 了研究和优化，并对 固定化酶和游离酶的酶学性质进行 了比较 。结 果表明，固定化酶的最适反应温度为 30~C，比游离酶高了50C；最适反应 pH值为 6．0，比游离酶低 了2个pH值 单位。该固定化酶的热稳定性 、酸碱稳定性和操作稳定性均高于游离酶 。 关键词 碳酸酐酶 固定化 硅藻土 Studieson ImmobilizationofCarbonicAnhydraseonCeliteandItsProperties GAOW eifang，XIAO Xiang，ZHANG Zhaohui CollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310014 Abstract CarbonicanhydraseiSimmobilizedonalkylatedcelitebymeansofcovalentbinding．Somefactors affectingtheactivityofimmobilizedcarbonicanhydrase，suchasthepH value，theloadofcarbonicanhydrase，reaction temperatureandreactiontimeareinvestigated．Thepropertiesofimmobilizedandfreeenzymearealsocompared．The resultsshow thattheoptimum temperatureoftheimmobilizedenzymeis30℃ ，whichis5℃ higherthanthatofthefree carbonicanhydrase；anditsoptimum pH valueis6．0，whichis2pH unitslowerthanthatofthefreeenzmy e．Thether— mal，pH andoperationalstabilityofimmobilizedenzymearealsosuperiortothefreeenzyme． Keywords carbonicanhydrase，immobilization，celite 碳酸酐酶 CA 是一类分布广泛的含锌金属酶 ，能高效 入另一个干燥的旋转蒸发瓶中，用甲苯淹没之，抽气 ，于4O～ 催化 CO。的可逆水合反应，在生物传感器[1]、C0 循环吸 6O℃水浴蒸出甲苯与水 的共沸物 ，以除尽硅藻土中的水分； 收_2等方面有着 良好 的应用前景。但游离酶在使用过程中 然后加入 10 的3一缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的 甲苯 存在稳定性差、难 以从反应体系中分离 回收等缺点，因此有 溶液 ，抽真空，室温下旋转反应过夜；在砂芯漏斗中用丙酮充 必要对其进行固定化。目前，国内外对碳酸酐酶的固定化已 分洗涤烷基化后的硅藻土颗粒并风干l5]。 有部分报道，采用的载体主要有丙烯酰胺聚合物、壳聚糖 、海 1．2．2 碳酸酐酶 的固定化 藻酸盐_3棚等，但是这些载体的活化过程繁琐、力学强度差、 取 0．1g上述烷基化后 的硅藻土颗粒 ，加入一定量含酶 比表面积小 。为了克服固定化材料的上述缺陷，本实验首次 液的磷酸盐缓冲液 ，150r／min恒温振摇反应一段时间，过滤 ， 尝试以烷基化的多孑L性硅藻土为载体，将碳酸酐酶固定化， 用相 同pH值的磷酸盐缓冲液洗涤载体 ，室温干燥至恒重，即 并对固定化酶的酶学性质进行了研究 。 制得固定化酶，置于 4℃冰箱中冷藏备用 。 1 实验 1．2．3 酶活力的测定 游离酶活力 的测定。在 比色皿 中依次加人 1．9mL 1．1 材料 15mmol／L的 TrisH2SO4缓 冲液 pH一 7．6 、0．1mL 碳酸酐酶，购 自上海美季生物技术有限公司；硅藻土 ，由 0．1mg／mL 的酶液和 1．0mL3mmol／L的对硝基乙酸苯酯， 杭州啤酒厂赠送 ；3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、对硝基 室温反应 5min后 ，用 751型紫#b／可见光分光光度计测定其 乙酸苯酯 ，购 自Sigma公司；其它试剂均为分析纯 。 在 348nm处的吸光度值，以不加酶液的样品为空白对照。酶 1．2 方法 活定义为：在室温下，每分