固定化酶反应器在高效液相色谱分析中的应用.pdfVIP

文献综述 固定化酶反应器在高效液相色谱分析中的应用 史 坚 都恒华 南（京大学化学系，210008） 高效液相色谱法 H（PLC）是分离含多组分的复 液及组织中微量成分分析的有力手段。 杂体系的最有效手段之一，但检测体系的灵敏度总 一、固定化酶反应器 不能令人满意。折光率检测器通用，但灵敏度不高； 紫外、荧光、电化学检测器要求化合物须有生色团、 酶的固定化技术就是通过物理或化学方法，将 荧光团和电活性基团。近年来，柱前和柱后标记方法 酶束缚在一定区间内制成仍具有催化活性的酶的衍 发展较快，扩大了这些检测器的应用范围。在标记方 生物。固定化酶对热、有机溶剂和pH的稳定性增加， 法中，固定化酶反应器 IM（ER）引起人们的关注，因 且易回收，重复使用。容易采用IMER形式，用于连续 为它的灵敏度高，选择性好，比较简单。对以上检测 流动体系中。 器不响应的化合物，通过酶转换后，生成具有高响应 一（）固定化方法 值的化合物。由于酶的专属性，大大提高了测定复杂 酶的固定化方法很多，有关固定化反应的背景 体系中痕量化合物的选择性。HPLC-IMER联用已广 知识可参见有关文献1,2]。目前最广泛使用的化学固 泛应用于临床分析，成了人体血清、血浆、尿、脑脊髓 定化是利用烷氨基多孔玻璃与戊二醛的反应： 此法简单，条件温和，载体的机械稳定性好，对许多 时间比。通常用于分析中的反应器 （100m，0.5 酶都适用。这种多孔玻璃 CPG）的孔径要足够大，以 5cm，比值为0.4，峰窄而对称。 使高分子量的酶分子顺利扩散至孔中，生成产物能 开管反应器类似于色谱中的毛细管柱。Iob和 迅速离开活性中心。其孔径又不能过大，否则比表面 Kojima将酶固定化技术与毛细管气相色谱技术相结 减小，使键合的酶分子相应减少。 合[3,4]，将 “毛胡子”石英毛细管柱技术移植到开管反 二（）IME 的类型 应器的制备中，以增加表面积。Gosnell等将CPG紧 不论何种反应器，都要求固定的酶量大，使底物 密填入Teflon或Tygon管内，封闭后加热，使玻珠膨 在短时间内转变成产物。在一级反应条件下，转化分 胀嵌入管壁后再进行酶固定化。这种柱子的活性高 数X（）可用下式表示： 于“毛胡子”柱，且制备简单[5] X＝1－exp[－ D（sVr/Q Reijn和Mottola等将预先经NH4HF2蚀刻的玻 酶负载因子 增加，酶量增加，流速Q可以加快，反 珠单颗排列在管内，再将酶键合其上[6,7]。这类单珠 应器体积Vr可减小。扩散系数Ds增加，有利底物转 线式反应器与相同长度的开管反应器相比，峰宽只 化。反应器的转换能力会被产物在检测器和连接管 有后者的1/7，峰高增加2.5倍。 道内的谱带展宽所抵消，因此在评估反应器时，必须 Thompson等比较了几种葡萄糖氧化酶及乳酸脱 同时评价酶活力和谱带展宽程度。 氢酶反应器的性能[8] 填充柱反应器类似于填充色谱柱，HPLC的理论 二、在HPLC中的应用 与技术同样适用。为控制展宽，最重要的是控制底物 扩散至载体所需的时间与它从柱内洗脱出来所需的 在HPLC中，柱后IMER的应用最为广泛。 一（）甾族化合物