动物线粒体DNA的快速制备及鉴定1).pdfVIP

遗传 HL12EDLTAS(Beijing 8(1);44-461986 动物线粒体DNA的快速制备及鉴定” 李筱平 窦永泽 杨磊 （中国科学院成都生物研究所：四川） 继Nass和S.Nass(1963-1965）以鸡胚为 溶液B-C:2多SDS,0.4NNaOH 用（时等 材料证明了线粒体中含有DNA，并与核DNA 量混合）。 有所不同之后，有关动、植物的线粒体 DNA 溶液D：3MNaAc,pH4.8o (mtDNA）的研究迅速开展起来。但就 mtDNA 4B柱洗脱平衡液： 0.01MTrisHCI-2M- 的制备方法而言，当今仍是经典的氯化艳密度 NaCl-1mA4EDTA,pH8.5o 梯度离心法41〔，其它还有 Borst16，及 Zasloff，等 缓冲透析液：0.01M Tris-HCI-O.O1MNa- 方法。 但这些方法所用仪器与试剂比较昂贵， CI-1mMEDTA,pH7.5o 现在国内的一般实验室中是不易推广应用的。 电泳缓冲液：89mm硼酸，25mMNa,EDTA, 如何在有一限的条件下，依据实验的目的和要求， 89mM Tris,pH8.3o 快速、简便地制备出所需的mtDNA，这便是我 内切酶消化液：lOmM TrisHCI,3mM 们开展有关研究的第一步。通过我们近来对制 MgCl,,lOmMNaCl,0.5mMEDTA,pH7.5o 备 mtDNA的有关方法的摸索和比较试验，筛 DNA溶解液：lOmMNaCl,1mMNa,EDTA, 选到一种能快速。简便地制备动物 mtDNA的 100mM Tris-HCI,pH7.9o 方法，采用 Se恤arose4B柱纯化，可得到较高纯 三（）操作方法 线粒体的制备仿照 度的mtDNAo Potter，的方法制备；mtDNA参考 Birnbeinm 等人的方法并作一定修改进行制备。详细制备 材 料 及 方 法 过程如下。 一（）试验材料 实验动物有猪、鸡、鸭、 1．线粒体的制备 取新鲜的或冷冻的 鹅、蟾蛛的肝脏及心脏以及蟾蛛的卵巢芽。这 肝、心脏或蟾赊卵巢25-50克，除去脂肪及结 些材料有的是从当地屠宰场购买，有的直接从 缔组织，剪碎，用SE液洗2-3次，除尽血污，再 野外产区采集。所需材料取好后，立即使用或 加SE液 W（/V= 1:5)，用海鸥匀浆机 Y（Q-3 置于一20℃低温冰箱中保存备用。 型）匀浆 慢（档）30秒左右，再用玻璃匀浆器匀 二（）试剂及溶液 SDS为国产化学纯 浆。匀浆液用600Xg(40C）离心20分钟，收集 用（时纯化）；琼脂糖由上海东海制药厂生产；限 上清液，去沉淀。上清液于10,000Xg。-C)离 制性内切酶从上海东风生化试剂厂、上海药物 心 10分钟左右，收集沉淀线粒体。 所及北京生物物理所订购；Sepharose4B从瑞 2.mtDNA 的制备 线粒体悬浮于二倍 典LKB公司购买。 体积的A液中，拌匀，加人二倍体积的B-C液， SE缓冲液：0.25M蔗糖，0.001MNa2EDTA, pH7.5,, LiXtaopingetal.:RapidPreparationand Identifi- 溶液A:50mM葡萄糖，lOmMNa2EDTA, cation ofM itocbondrialDNAsfrom Animal 1)承我室张仪裳同志协助电镜照相，特此致谢。 25mM