蛋白质双向电泳 .ppt

蛋白质双向电泳 蛋白质组学（proteomics） 概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变化的一门科学 研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最终确定它们的功能 技术流程 双向电泳(2DE/DIGE) 目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术 能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析 双向电泳（2DE）示意图 2DE图谱 双向电泳（DIGE）示意图 DIGE图谱 样品制备 双向电泳的最关键步骤之一 制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质 等电聚焦 通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦 步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。 胶条平衡 等电聚焦结束后进行SDS电泳之前需进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分结合，保证SDS电泳的顺利进行 步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次 SDS电泳 使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离，与普通SDS相似 在双向电泳系统中无需浓缩胶，因为第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩 蛋白检测 理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy） 蛋白检测 硝酸银染色 优点：灵敏度高， 缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色： 优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等 图像分析 常用软件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad) 分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析 * * 双向电泳(2DE/DIGE) 实验组和对照组样品制备 提出 生物学问题 凝胶图像分析 差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定 生物学问题的解释 提取的总蛋白溶液 等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离 上海博苑生物科技有限公司 SDS分离，使得蛋白质按分子量大小排序 分子量 大 小 通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离 硝酸银染色图谱 考马斯亮蓝染色图谱 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 样品1： Cy3标记 样品2： Cy5标记 将标记的 样品混合 双向电泳分离 荧光扫描仪扫描 图像重叠分析 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司 上海博苑生物科技有限公司