实时荧光定量PCR筛选牛源整联蛋白αv基因的siRNA片段.pdfVIP

动物医学进展 ，201l，32(3)：56—60 ProgressinVeterinaryM edicine 实时荧光定量 PCR筛选牛源整联蛋白 v基因的siRNA片段 张国峰 ，独军政，常惠芸 ，薛 霜，骆继怀 (中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽 病毒学重点开放实验室 国家 口蹄疫参考实验室 ，甘肃兰州 730046) 摘 要：设计并合成三条针对牛 口蹄疫病毒 (FMDV)整联蛋 白受体 dv亚基基 因的特异性干扰小 RNA (siRNA)片段 ，将其转染至本身表达整联蛋 白受体 CCV亚基基因的MDBK细胞。分别在转染后 36h和48h 收集细胞 ，提取细胞 总 RNA并反转录为 cDNA。应用 SYBRGreenI实时荧光定量 RT—PCR 的方法检测 3 个 siRNA片段 的干扰效果 ，筛选 出对整联蛋 白I(V基 因具有高效干扰效果的小RNA 片段。为建立抗 口蹄疫 病毒牛新品种培育的RNA干扰转基 因技术平 台奠定 了基础。 关键词：实时荧光定量PCR；整联蛋 白；RNA干扰 ；SYBRGreenI 中图分类号 ：Q786 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2011)03—0056—05 口蹄疫 (Footandmouthdisease，FMD)被世界 靶基因的细胞 内，应用 SYBRGreenI实时荧光定 动物卫生组织 (OIE)列为发病必须报告的动物传染 量 PCR[4方法 ，筛选对 目的基因具有高效抑制效果 病之一。口蹄疫病毒 (FMDV)属小 RNA病毒科 口 的siRNA片段 ，为下一步构建沉默载体 奠定 了基 蹄疫病毒属 ，病毒粒子表面的特征是由VP1的 140 础 。 位～160位的66和 BH 链形成 的G—H 环突出于表 1 材料与方法 面， H环含有高度保守的 RGD基序 ，这一基序既 1．1 材料 是病毒重要的中和位点 ，又是细胞 吸附位点的主要 MDBK细胞系 由兰州兽 医研究所家畜疫病病 部分。整联蛋 白(integrin)分子可与含有 RGD基序 原生物学国家重点实验室保存，MEM 细胞培养液 、 的蛋白配体结合，故整联蛋 白在介导 口蹄疫病毒侵 胎牛血清 (FBS)、胰酶、双抗 (penicillin-streptomy- 染细胞过程中起着重要的载体作用。研究表明，至 cin)均为 Hyclone公 司产 品。Opti-MEM IMedi- 少有 av口3、avJ36、avp1、a~f38等 4种整联蛋 白能与 um，脂质体 LipofectionTM2000均为 Invitrogen公司 H环上的RGD基序作用 ，介导FMDV 的感染，其 中 产品，RNA 提取试剂盒 RNeasyMiniKit为 QIA— av亚基是 4种受体的通用亚基n]。另一方面，近年 GEN公司产品种 ，50bpDNAMarker、DNaseI、 来的研究表明，将与 目标 mRNA对应的正义 RNA RNase—freewater、反转录试剂盒、荧光染料试剂盒 和反义 RNA组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞 ， SYBRPremixExTag均为宝生物工程 (大连)有限 可以使 目标 mRNA发生特异性的降解 ，导致其相应