实验六血清ALT活性测定1.ppt

实验六 血清ALT活性测定 一、何谓ALT？ 谷丙转氨酶 （glutamic pyruvic transaminase，GPT） 丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT） 三、ALT的分布: 主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血清中的含量很低。 病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。 五、测定血清ALT的方法： King法（金氏法） Reitman法（赖氏法） Mohun法（穆氏法） 实验六  血清ALT活性测定 ---改良赖氏法 一、实验性质：分析性 二、目的及要求 1、掌握ALT测定的原理及临床意义 2、熟习测定的操作方法。 三、原理 ： 在一定反应条件下 ( pH7.4，37℃ ) , 作用 30 min： 四、试剂：省略 α-酮戊二酸 1、将 基质缓冲液 和 血清 在 37℃ 水浴箱 预温5min。 七、注意事项： 1．一般血清标本内源性酮酸很少，血 清对照管吸光度读数接近试剂空白管 ( 以 0.1ml蒸馏水或生理盐水代替血清，其它和对 照管同样操作)，所以大批标本测定时，一般 不需要每一标本都作血清对照管，以试剂空 白管代替即可。但建议对超过正常的标本进 行复查，复查时每份标本应作对照管。 2．严重脂血症或黄疸、溶血的血清可 能会引起测定管吸光度增加，因此检测此类 标本时，应作血清对照管。 3．赖氏法原法标准曲线只到97卡门 氏单位，直线关系很好。超过此活力的标本 应稀释后再测，临床上应用甚为不便，故卫 生部临检中心推荐法建议标准曲线延长到 150卡门氏单位，实际已不完全成直线了， 只能大致反应酶活性的大小、当血清标本酶 活性超过150卡门氏单位时，应将血清用生理盐水或缓冲液稀释5倍后再进 行测定。 4．加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸光度读数的差异。 5．基质缓冲液和 2,4-二硝基苯肼溶液配制必须准确，每次测定时空白管吸光度上下波动不应超过0.015，如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。 八、实验报告： 九、思考题： * * 复习： 反应式 大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。 二、ALT催化的化学反应: 丙氨酸 +α-酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸 ALT 四、ALT测定的临床意义： 作为（肝脏）疾病诊断和预后判断的指标之一。 1981年全国生化检验方法学讨论会确定用赖氏法（改良）作为临床首选，单位为：卡门氏单位 。 丙氨酸 +α-酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸 ALT（血清） 基质液 丙酮酸 + 2,4 二硝基苯肼 α-酮戊二酸-2,4二硝基苯腙 丙酮酸-2,4 二硝基苯腙 两者在 碱性条件下 呈 红棕色 ，等摩尔浓度条件下，丙酮酸 OD 值 大 a-酮戊二酸 3倍。 2、按下表操作： 加入物 （ml） 对照管 (B) 测定管 (U) 血清 0.1 0.1 基质缓冲液 — 0.5 混匀，37℃水浴30min（准确记时） 2,4—二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 基质缓冲液 0.5 — 混匀，37℃水浴20min； 各管加入0.4 M NaOH 5.0 ml，室温放置10 min； 在波长505 nm 处，以蒸馏水校正零点，读取各管吸光 度；根据 (AU--AB) 标准曲线，得到酶活性的卡门氏单位数。 五、操作步骤： 3、标准曲线的绘制： 管号 0 1 2