HO-1对原代培养大鼠AEC-Ⅱ细胞凋亡及Bcl-2、p53的影响.pdfVIP

被的培养皿中，培养箱内吸附纯化2．0～2．5h，收 x 106 集细胞，离心重悬。将细胞浓度调至约1-2 抗体(1：looo)4℃振摇孵育过夜，再加入辣根过 7i／mL，原代培养24h【2j。将同批次AEC—II细胞 氧化物酶标记的二抗(1：2000)，化学发光法检 One 等量分为4组：正常组给予生理盐水；H：0：组 测，Quantity4．6．7凝胶图像分析软件分析各 mmobL (B组)加入0．5 H202；HO—l组(C组)个蛋白条带的校对积分光密度，实验重复6次。 加入0．5mmol／L HO— 1．3统计学方法 H202然后加入0．2IJ,mol／L mmol／L 全部资料的整理、分析均采用SPSS13．0统计 l【21，抑制组(D组)加入O．5H202然后 20 学软件进行，计量资料以均数±标准差(孑±s)表 ／Jn)k锌原卟啉Ⅸ”J I出mol／L。孵育结束后，按照 Annexin 示，组间比较采用单因素方差分析(ONe—way V·FITC细胞凋亡试剂盒操作(碧云天生物 研究所)进行流式细胞仪检测细胞凋亡率，应用 Western 及图像采集采用单盲法，即采样及收集数据时由实 blot法观察凋亡相关蛋白Bel-2、p53的表 达。 验室流式细胞仪操作人员完成，不告知具体组剐。 1．2检测指标 2 结果 1．2．1 流式细胞仪检测 消化并收集贴壁的 2．1流式细胞仪检测 AEC．1I，PBS洗两次．重悬于结合液中。取细胞 悬液与AnnexinV-FITC及PI于室温下黑暗处孵育同时间点：与正常组比较，H：0：组AEC-Ⅱ细 15rain。按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P0．05)， 操作，流式细胞仪(BectonDickinson，流式细胞随H：0：刺激时间延长，诱导AEC—II细胞凋亡率 仪，USA)进行检测，Cellquest分析软件进行分 析，实验重复6次。 率明显降低，差异有统计学意义(P0．05)；与 1．2．2Western blot法RIPA裂解液提取细胞总HO一1组比较，抑制组AEC-II细胞凋亡率明显增 蛋白，BCA法定量蛋白。取30jxg蛋白质上样，加，差异有统计学意义(P0．05)。(见表1)。 12％SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至 表1 HO—l对原代培养大鼠AEC-II细胞凋亡率的影响(n=6，孑±s) 注：与止常组比较。▲PO．05；与H202组比较．。P(O．05；与HO—l组比较．·PO．05 2．2 Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2； 3讨论 p53的表达In=6，叉±s) 正常组Bcl-2(21．96±2．48)表达增加，p53 (90．95±7．85)；与正常组比较，HO—l组Bel-2 氧化损伤模型是研究急性肺损伤病理生理过程及治 (66．76±6．08)表达增加，p53(55．44±5．37) 疗的常用模型之一。本实验结果显示(如表1)： 表达减少(P0．05)；与HO-1组比较，H202组 H：O：