2015年临床免疫检验高级职称考试考点点评.docVIP

　　2015年临床免疫检验高级职称考试考点点评 　　有关临床免疫检验高级职称考试的知识，助考之星老师通过本文详细梳理如下，供广大考生参考复习。 　　一、免疫金的特性和制备 　　(一)免疫金的特性 　　胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金(immunogold)。 　　胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。 　　(二)免疫金的制备 　　1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。 　　在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG，20000)稳定胶体金后，再胶体金的pH值。 　　2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。 　　由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。 　　3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。 　　4.离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 　　5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 　　6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。 　　多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。 　　二、肿瘤坏死因子的检测 　　（一）、生物学检测法 　　TNF的主要生物学活性之一就是对某些肿瘤细胞的细胞毒作用。根据这一特点，可利用TNF敏感的靶细胞测定TNF活性，根据细胞死亡得出TNF的相对活性。该法的关键是选择敏感特异的靶细胞。靶细胞可以是长期传代培养的细胞系，也可以是新鲜分离的原代细胞(如瘤细胞)。现以贴壁生长的L929细胞为例，简述TNF活性的检测原则。 　　两种TNF均可伤体外培养的L929细胞，细胞死亡率与TNF活性成正比。某些染料如中性红、结晶紫等能使活细胞染上相应颜色，再用脱色液将染料脱出，通过测定其吸亮度值间接监没细胞存活状态。 　　试验原则是收集对数生长期的L929细胞，用培养液调细胞至适当浓度，加入培养板小孔中，置37℃，5%CO2温箱中培养16～24h，换液后，在各孔中加入不同稀释度的待检样品，再加适当浓度的放线菌素D和适量培养液，继续温育16～24h，弃培养液，经Hanks液洗涤后，每孔加入适当浓度的结晶紫染色液，37℃培养1h，使活细胞充分着色。 　　然后各孔加1%SDS短时温育使染色细胞溶解，再以酶标测定仪测各孔A570nm值。每次检测均设培养液(阴性)对照和不同浓度的rTNF(阴性)对照。以使阴性对照50%细胞溶解的标本最大稀释倍数为TNF活性单位，以u/ml表示。 　　由于放线菌素D能抑制DNA的合成、降低靶细胞对损伤的修复机制，因而在检测中加入放线素D可使靶细胞对TNF的敏感性增高10～200倍。 　　（二）、免疫学检测法 　　通常采用ELISA，该法特异性高、敏感性强且快速使捷，而且能够区别TNFα和TNFβ，为临床检测病人血清中TNF水平的有效方法，但不能反映TNF活性。 　　（三）、其它检测法 　　检测TNF还可用生物发光法及NAG微量酶反应比色法。这类方法是应用生化技术检测细胞内代谢的变化，从而推知靶细胞功能变化及死亡情况。其优点是不仅反映细胞的死亡情况，而且能反映细胞的功能变化。此外，还具有快速、方便、微量的特点。 　　更多有关临床免疫检验高级职称考试的考点和考试资讯，推荐阅读：临床免疫检验高级职称考试(题库）软件 医学