6阳性重组子的转化及基因组DNA的提取.pptVIP

重组质粒转化表达菌株 基因组DNA的提取 * 基因的克隆与表达专题之六 制备感受态细胞流 程 扩大培养： 0.5mL预培养菌液＋  40mL LB液体培养基（含34.4μg/mL Cam）  37 ℃ 、250rpm振荡培养2.5-3小时 BL21 placI 收集细胞： 终止培养（OD600 0.4-0.5 ）转移菌液到50mL离心管中，冰浴10min 离心（4℃， 4000rpm × 10min ）！！！ 弃液: 倒出培养液，将管倒置使培养液流尽 制备感受态： 穿孔：加入预冷的CaCl2（ 0.1 mol/L，10mL） 轻柔吹悬菌体细胞（用5 mL枪头） 冰浴 30min 收集：离心（4℃，4000rpm × 5min），弃上清 保存：预冷的CaCl2 （0.1 mol/L， 2mL） 冰上轻柔吹悬菌体细胞 分装保存：200uL/份（ -20 ℃短期或-70 ℃稍长期冻存） 连接产物转化表达菌株 1、样品制备 用枪头轻柔混匀，冰上放置30min 注：实验管每人做一份，四个对照管每组作一份 感受态细胞 (200μL )＋未重组空质粒（1μL） 阳性对照1 0.1 mol/L CaCl2 (200μL)＋阳性重组质粒（1μL） 感受态细胞(200μL)＋ 无菌水2μL 感受态细胞 (200μL)＋ pETBlue－2-AKP质粒（2μL) 感受态细胞(200μL) ＋阳性重组质粒（1μL） 阴性对照2 阴性对照1 阳性对照2 实验管 注意：无菌！轻柔！冰浴！ 2、转化 42 ℃水浴热激90秒 冰浴2分钟 3、复苏 每管加800μL LB液体培养基  37 ℃慢摇1小时（150rpm ） 4、制备琼脂培养平板：  200mL LB固体培养基(含2％琼脂)，灭菌后待温度 降到60℃左右，加入34.4μg/mL Cam、50μg/ mL Carb 混匀,立即铺平板9块 5、涂板培养： 浓缩菌液：将复苏后的菌液离心（4000rpm × 1min） 吸弃900uL上清，吹悬剩余细胞 涂 板： 取50uL细胞悬液，涂布在选择平板上， 正置10～20min后，倒置37 ℃培养过夜 配制液体并高压 1、LB液体培养基 250mL 胰蛋白胨（typtone) 2g 酵母提取物（yeast extract) 1g NaCl 2g 葡萄糖 2g 先加200mL水溶解后，再加40μL 5mol/L NaOH。 分装：15ml大试管： 9管×4mL/管 余下的用于配置LB固体培养基 2、LB固体培养基 200 mL LB液体培养基中含1.2％的琼脂粉，灭菌后待 温度降到60℃左右，加入50μg/mL Carb、 34.4μg/ mL Cam ，混匀,立即铺平板9块 3. 表达培养基 300mL 胰蛋白胨 3.6g 酵母提取物 7.2g 氯化钠 3.0g 葡萄糖 3.0g 甘油 1.8mL 加入250mL蒸馏水溶解，用1mol/L Tris调pH至7.4 （0.93 mL 1mol/L Tris）, 再用蒸馏水补至300毫 升，平均分装到4个250mL的三角瓶中 115℃高压蒸 汽灭菌20分钟。 4、 0.9% 生理盐水： 1000mL/班 5、 组织匀浆液 pH 8.0 200mL/班 10 mmol/L Tris.HCl 25 mmol/L EDTA 100 mmol/L NaCl 6、酶解液 pH 8.0 20mL/班 20 mmol/L Tris.HCl 50 mmol/L EDTA 200 mmol/L NaCl 200 ug/mL蛋白酶K 1％ SDS 基因组DNA的杂交专题之一 *