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D-半乳糖致衰老模型小鼠皮肤衰老的观察 关键词：?皮肤衰老?半乳糖2008-07-14 00:00?来源：丁香园?点击次数：1741 [摘要]?目的?观察D-半乳糖连续皮下注射对小鼠皮肤衰老指标的影响。方法?3月龄KM雌性小鼠60只,随机分为空白对照组(注射生理盐水)、D-半乳糖低剂量组(80mg/kg)和D-半乳糖高剂量组(1000mg/kg),连续每日背部皮下注射42天后,观察小鼠皮肤中与衰老相关的生化指标及组织病理学变化,并用计算机图像分析系统定量分析。结果　高剂量组小鼠真皮厚度〔(624.5±48.5)μm〕较对照组〔(839.3±58.4)μm〕显著变薄(P0.05),胶原纤维减少,排列疏松,弹力纤维总面积亦显著减少(P0.05);高剂量组皮肤中超氧化物歧化酶(SOD)活性〔(131.2±11.5) U/ml〕、羟脯氨酸含量〔(0.57±0.13)μg/mg〕显著低于对照组的〔(178.1±20.7) U/ml、(0.74±0.17)μg /mg,P0.05〕,丙二醛(MDA)含量增加〔(9.4±1.5)nmol/g和(6.8±1.5)nmol/g,P0.05〕;而低剂量组上述改变则不显著。结论　每日1000mg/kg D-半乳糖连续皮下注射42天,可导致小鼠皮肤的明显衰老,为抗皮肤衰老研究提供一个简便、稳定的实验模型。 衰老是生物体在生命周期中随年龄增长而发生的全身组织、器官功能减退和稳态下降的过程。随着世界人口加速老龄化,抗衰老研究已成为迅速崛起的一门应用科学。若在人体上进行这一漫长衰老过程的研究及对抗衰老药物进行疗效观察是不易做到的,因此,人们根据衰老的机制建立了许多动物衰老模型。目前,应用最多的是D-半乳糖所致的亚急性衰老模型,它可引起心、肝、肾、脑等重要器官的代谢异常,类似人类自然衰老时的表现[1]。我们于2003年1~6月采用KM雌性小鼠连续皮下注射D-半乳糖,建立小鼠亚急性衰老模型,观察衰老小鼠皮肤中与衰老相关的生化指标及组织病理学变化,为皮肤抗衰老研究提供实验工具。 材料和方法 一、材料与仪器 1.实验动物:选用3月龄清洁级KM雌性小鼠60只(广东医学院实验动物中心提供),平均体重(30±2)g,标准饲料饲养。 2.实验仪器:AE-240型电子分析天平(上海Mettler-Toledo仪器有限公司),JB-2型恒温磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂),SHHW21.600三用电热恒温水浴箱子(天津市华北实验仪器有限公司),DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱子(上海医用恒温设备厂),752型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂),内切式组织匀浆机(浙西机械厂);55P-72超速离心机(日本Hitacht公司);计算机图象数字化分析系统(德国LEICA公司)。 3.主要试剂:D-半乳糖(上海试剂二厂);盐酸苄胺(上海试剂厂);硫代巴比妥酸(TBA,美国Sigma公司);四乙二氧基丙烷(瑞士Fluka公司);L-羟脯氨酸(中科院上海生化所);DTNB(德国Feinbiochemica公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物科技公司);考马斯亮蓝G250(瑞士Fluka公司);其余试剂均为市售分析纯。 二、实验方法 1.动物分组、给药及处理:动物随机分为3组:空白对照组、D-半乳糖低剂量组和D-半乳糖高剂量组,每组20只。对照组:每日背部皮下注射生理盐水0·2 ml。低剂量组:每日背部皮下注射D-半乳糖80 mg/kg;高剂量组:每日背部皮下注射D-半乳糖1000 mg/kg,注射均按无菌操作进行。42天后,所有小鼠摘眼球放血处死,立即检测全血中过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力;取背部正中皮肤0.5 cm×0.5 cm大小,迅速放入10%中性福尔马林液中固定,拟作组织切片进行组织形态学观察及定量分析;余背部皮肤取下后迅速冰冻保存,拟作皮肤组织匀浆及测定皮肤羟脯氨酸之用。 2.10%皮肤匀浆的制备:取脱毛背部皮肤组织0.5 g,经预冷生理盐水漂洗,除去皮下脂肪和其它结缔组织,滤纸拭干,称重,量筒量取该组织块9倍重量预冷生理盐水,用内切式组织匀浆机制成10%组织匀浆(在冰水中),反复冻融3次,使细胞完全破碎,内容物全部游离在液相中。 3.全血CAT及GSH-Px活力测定:取新鲜30% H2O2液0.5 ml加蒸馏水50 ml混匀,从中取出4 ml,加入pH7.0的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液26 ml,紫外分光光度计测定其230 nm波长处1 cm光路A值,调节A值在0.50~0.55之间,作为CAT底物液。25条件下,取底物液3 ml,迅速加入1:50溶血液0.01 ml,230 nm波长处立即测定其A值,1min后再测其A值,同时测定蛋白质含量。GSH-Px活力测定参照南京