RealTimeRTPCR常见问题分析.docVIP

Real-Time RT-PCR常见问题分析 1.某一孔荧光信号特别强 问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？ 原因：① 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；② 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③ 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染； 2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰 问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？ 原因：① 反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③ 如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换； 3. 部分样本扩增效率过低 问题：部分样本扩增效率过低？ 原因：① 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；② 反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效； 4. 阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染。2、模板提取操作有污染。3、配液过程存在污染。 问题：阴性对照或空白对照翘尾？ 原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染； 5. 直线型扩增曲线 问题：直线型扩增曲线？ 原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融――稀释的探针可在4℃保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物； 6.没有扩增曲线 问题： 没有扩增曲线？ 原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；②电脑设定了自动休眠； 7.基线下滑 问题： 扩增曲线有一个下滑阶段？ 原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致； 8.扩增曲线断裂 问题：扩增曲线断裂？ 原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值＜15，而基线范围仍取3－15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据 9.样品浓度跨度过大 样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。 10.山坡形曲线 问题：山坡形曲线？ 原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。