RegIV基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNARegIV的构建与转染.pdfVIP

RegIV基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及 pcDNA-RegIV的构建与转染1 高峰，郑声琴，张宇伟，金月玲，田小强，黄培林 东南大学医学院病理学系 (210009) E-mail ：hpl@ 摘要 : 目的 探讨 RegIV 基因在四种结直肠癌细胞系中的表达水平，构建并转染 pcDNA-RegIV 重组质粒，为阐明 RegIV 基因在结直肠癌发生发展中的作用机制奠定基础； 方法 采用 RT-PCR 方法检测 HT-29 、CaCo2、Sw480、LoVo 细胞系的 RegIV 基因的表达水 平，将获得目的基因 RegIV 克隆于 pcDNA3.1⁄ （−）质粒上，用PCR 、酶切进行鉴定后，脂 质体转染至低表达甚至不表达 RegIV 的结直癌细胞系，用 G418 筛选后进行RT-PCR 鉴定； 结果 HT-29 、CaCo2 细胞系 RegIV 基因高表达，Sw480 细胞系表达较前两者弱，LoVo 细胞 系RegIV 阴性表达；构建的重组质粒中含有RegIV 基因，经 pcDNA-RegIV 转染的 LoVo 细 胞 RegIV 基因呈阳性表达；结论 RegIV 基因在不同的结直肠癌细胞系中表达水平不同，成 功构建和转染了 pcDNA-RegIV 可使得 RegIV （- ）的LoVo 细胞系 RegIV 基因呈阳性表达。 关键词: RegIV基因，结直肠癌，重组质粒，基因表达，基因转染 RegIV是Reg家族中的一个在结直肠腺瘤高表达的差异表达基因，它的高表达与腺瘤的形 成、腺癌的发生有关[1-3] [4] ；并用反向Northern Blot得以证实 。尤其在癌前病变（腺瘤、溃 疡性结肠炎[5]）、结直肠腺瘤癌变区的高表达提示它可能是一个消化系统癌微转移的有效生 物标记物。 目前 RegIV基因在结直肠癌中的表达改变已逐渐被人们所关注，但 RegIV 在癌中的上调 是一种癌发生的伴随现象，还是一种肿瘤特异性的反应？或者只是组织损伤的敏感的反应 物？还是在癌中起癌基因的作用？等问题尚未阐明。本实验通过检测 RegIV 基因在四种结直 肠细胞系中的 mRNA 表达水平，然后将高表达 RegIV 的 cDNA 目的基因构建成重组质粒 pcDNA-RegIV，转染[6，7]低表达甚至不表达 RegIV 的结直肠癌细胞系中，为 RegIV 在癌发 生中的作用机制的阐明提供了一个有效可靠的方法。 1. 材料与方法 1.1 材料 E.coli DH5α 大肠杆菌为东南大学分子病理研究所保存；HT29、Sw480、 Caco2、LoVo 细胞系购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所；pcDNA3.1⁄ （−）质粒、Trizol、 1本课题得到国家自然科学基金资助 1 Lipofectamine 2000 为 Invitrogen 公司产品； DEPC 购自南京凯基公司；Rnase、Marker IV 购自南京天为时代公司；RT-PCR 试剂盒、EcoR1、BamH1、T4连接酶、PCR Purification Kit 购自大连宝生物公司；100bp Mark 购自申能博彩公司；G418 购自 Gibco 公司；无内毒素质 粒中提试剂盒购自 Promega 公司。 1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成[6] 根据 Genebank RegIV 基因 cds 序列（全长 477bp）和 pcDNA3.1⁄ （−）质粒特点，按照 酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并附带相应的酶切位点： 上游引物：5′-CATGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG-3′； 下游引物：5′-CGCGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAG-3′ 另外，设计一对片段长度为 270bp