RTPCR中遇到的问题及解决方法.docVIP

RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法 摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。 RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。oligo: 多聚体，相当于mRNA引物 　　AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶 　　MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转酶 　　dNTPs：脱氧核苷酸 　　RNase：RNA酶抑制剂 　　PCR Buffer：RT-PCR缓冲液 MgCl2：2价镁离子RT－PCR反应体系(25ul)：无酶水　　　　　　　　　　　　14.4ul?AMV Buff目的基因　　　　　　　5ul?dNTP　　　　　　　　　　　　 0.5ul目的基因上游引物 0.75ul目的基因下游引物 0.75ulGAPDH上游引物 0.75ulGAPDH下游引物 0.75ulMgSO4 0.8ulTfl DNA Poly 0.5ul?RNA 0.8ul 将上述各成分混匀并覆盖石蜡油20 μl，标注号码后放入基因扩增仪内。RT-PCR扩增的条件与参数：48，45min，94，2min； 94 30s，58 60s，68 2min共40个循环；循环完毕后68延伸7min。扩增产物进行电泳或-20oC冻存1.RNA被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；2.RNA中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂；3.多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；4.用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列；5.起始RNA量不够：增加RNA量；对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA；6.RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提高逆转录反应温度，对SuperScript可以到50，对ThermoScript可以到65。注意：不要在＞60时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65。注意：不要在高于37时使用M-MLV；如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物；7.引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。8.靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。PCR引物设计较差：避免在引物3端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。10.富含GC的模板：于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。11.镁离子浓度太低：从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于