1血球计数板操作规程.docVIP

目的 Purpose 规范计数板的标准操作，确保设备的操作有章可循。 范围 Scope 适用于计数板的日常使用。 职责 Responsibility 质检部的检验员负责遵守该规程，质检部负责人负责监督与管理。 内容Procedure 1 概述 1.1 测定微生物细胞和动物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 1.2 显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等 1.3 血球计数板 1.3.1 是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。 1.3.2 中间平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方网格（图1）。 图1：血细胞计数板构造（一） 图2：血细胞计数板构造（二）1.3.3 每个方网格分为9个大方格，正中间的大方格为计数室，计数室内的刻度有两种：一种是每个计数室内分为16个中方格（中方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格（图2）；另一种是每个计数室内分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数室内都由400个小方格组成。1.3.4 计数室边长为1mm，则计数室的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数室的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。1.3.5 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物或细胞的数量，再换算成每毫升样液（或每克样品）中微生物或细胞的数量。已知：1cm3体积=10mm×10mm×10mm=1000mm3=1ml；所以：1cm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。因此：每ml悬液含细胞数=每个小格中细胞平均数（N1）×系数（K）×悬液稀释倍数（D）。 1.4 现用的计数板规格型号为XB-K-25，表示此计数板分25个中格。 2 计数板的使用2.1 准备：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检；若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；盖玻片也要擦干净。2.2 盖上盖玻片：在需要盖的周边区域用蒸馏水弄的微湿，然后盖玻片要慢慢的从计数板的前端推入，直到盖玻片的前端边缘与计数板的划有方网格的区域处于同位。2.3 计数板加样：取一个良好混合型的洁净吸管，吸取按要求稀释D倍的供试品稀释液；把吸管的外部擦干，然后保持吸管一定的角度并挤出一个小滴液体至吸管口尖端；然后这滴液体被放置在盖玻片和计数板之间。利用盖玻片和计数板之间的毛细管现象和液体的表面张力使两个平面之间的缝隙被灌满，液体充满计数室，在溶液要满出计数板截面的边缘之前，马上移走吸管的尖端，充入悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜，多余培养液可用滤纸吸去。如果有可见气泡或者液体已经满出边缘并且进入其他的沟里，那么计数板就要擦干净并且重新加样。 2.4 计数： 2.4.1 静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，按显微镜标准操作规程操作，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜找到视野，观察并计数；记录计数的小方格数（B）及其小方格内的供试品细胞总数量（A）。 2.4.2 操作时，显微镜的照明是重要的，由于活细胞的折光率和水的折光率相近，太亮了会影响方网格线的观察，观察时应减弱光照的强度。操作高倍物镜时也要非常小心，因为计数板比常规的要更厚。如果不小心的话，会导致计数板或者物镜镜头的损伤。2.4.3 对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N1），按公式计算出每ml悬液所含酵母菌细胞数量。 2.5 计数时若计数区是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的细胞数。如果是25个中方格组成的计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央l个中方格的细胞数（即80个小格）。如细胞体位于中方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差（图3）。 图3：计数原则：取上不取下，取左不取右。 2.6 计算：按下述公式进行计算： N=(A/B)KD。 其中：N:代表供试品样液的浓度，单位为：个/ml； A:代表计数小方格内的供试品总细胞数，单位：个； B:代表所计数的小方格数，单位：个； K：代表计数室体积由mm3换算为ml的换算系数，K=4×1