研究进展-PVY.docVIP

1.2 马铃薯 Y 病毒的生物学特性与基因组结构特征 1.2.1 马铃薯 Y 病毒的生物学特性 马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯 Y 病毒属的典型成员，能侵染茄科、藜科、豆科、葫芦科等多种植物，是烟草、马铃薯、番茄和辣椒等多种茄科作物病毒病的主要病原之一，并常与烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）混合侵染，严重影响烟草品质，造成巨大的经济损失。在Potyvirus属病毒的分类上，一般广泛接受的是，1988年Shukla和Ward提出的Potyvirus属的划分标准，即CP的氨基酸序列同源性在38%-71%之间（平均54%）的为不同种的病毒，在90%-99%之间的为同一个种病毒的不同株系，大于99%的为同一株系的不同分离物[35]。按照这一标准，可以将常见的PVY株系分为3个株系：PVY -O称为普通株系，可以引起马铃薯严重的皱缩或条纹落叶病以及烟草的系统斑驳症状；PVY-N称为脉坏死株系，引起绝大多数马铃薯栽培品种叶片无症或很轻度的斑驳病症，造成烟草严重的系统脉坏死；PVY-C称为点条纹株系，可以在许多马铃薯栽培品种上引起 条痕花叶症状等过敏性反应[36]，在其它一些品种上造成系统性花叶，而在烟草上症状 与PVY-O的类似[37] 。1.2.2 马铃薯 Y 病毒的基因组结构与功能 马铃薯 Y 病毒蛋白是多聚蛋白，PVY 含有大小约 10 kb 的正单链 RNA 基因组。 该基因组仅含一个长的开放阅读框架（ORF），进行表达时先翻译成一个大的多聚蛋 白（图 2），再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成成熟的蛋白质来行使各种功 能。 马铃薯Y病毒病毒编码的多聚蛋白含有以下蛋白：P1主要功能是在多聚蛋白加工（蛋白酶）、基因组复制、症状表达等起作用，此外还是序列特异基因沉默的辅助因子；HC-Pro主要功能是在基因组扩增、自身互作、系统移动、抑制基因沉默、细胞间及长距离运输、协生和症状表达、种传等方面起作用；P3主要影响基因组复制、多聚蛋白加工，此外P3还是RsvI介导的致死性系统过敏反应的激发子[38]； 6K1主要功能是与膜结合、参与复制、PSbMV中决定无毒性；CI在细胞间运动、复制（RNA解旋酶）、症状产生等方面起作用； 6K2具有膜结合功能、参与复制、系统移动；NIa蛋白酶，以顺式及反式方式起作用，可以结合RNA，是Rym介导性的激发子，具有Dnase活性[39]；Nib可以参与病毒基因组的扩增；外壳蛋白CP参与细胞间长距离运输，蚜虫传播和基因组扩增。此外，PVY 5′端非编码区VPg蛋白在5′端的结合过程、病毒粒子的起始装配或RNA复制酶的识别信号等方面起到相关作用。PVY的终止密码子与Poly (A)之间有一段3′端非编码区，可能在负链RNA的复制起始中发挥作用[40, 41]。 1.2.3 PVY Hc-pro 基因的功能研究 HC-Pro是一个多功能蛋白，参与病毒生活史中的许多过程。Atreya（1993）、Kle（1994）等在研究烟草脉斑驳病毒（TVMV）时发现HC-Pro蛋白参与病毒自身的复制和症状的表现[42, 43]。Klein（1994）发现HC-Pro与病毒移动有关，在TVMV HC-Pro中插入4个氨基酸导致该病毒不能在植物体内进行系统移动[43]。Rojas（1997）证明HC-Pro可以增加胞间连丝的体积排阻限度（SEL），促进病毒RNA在细胞间的移动[44]，这些研究表明HC-Pro参与了马铃薯Y病毒属病毒的移动。 HC-Pro可抑制植物的基因沉默，是一个RNA沉默的抑制子。研究发现表达TEVP1/HC-Pro基因的转基因植株对PVX的侵染特别敏感，反式激活病毒的复制，使PVX的积累量增加，出现PVX和TEV协同侵染时一样的典型症状，增强其致病性，使病毒的危害加重。缺少HC-Pro锌指结构域的TEV突变株与PVX一起也可以引起典型的协生症状，而如果将PVX与HC-Pro中央区域突变了的TEV一起接种，就没有协生作用，从而证明抑制植物的基因沉默过程中起作用的是HC-Pro的中央区域，而不是其氨基端的“锌指结构”[45]。 HC-Pro决定蚜传特性且一个特定病毒的HC-Pro能有效地介导其它某些病毒（但不是所有病毒）的传播，表明HC-Pro的蚜传活性有某种程度的专化性[46]。此外Carrington通过一系列的实验证明了HC-Pro的蛋白酶切活性[47]。 2.2.2 叶片总 RNA 的提取 根据 Indirect-ELISA 方法鉴定的结果，选取 ELISA 结果呈阳性的样品，按 Trizol 方法提取总 RNA。 （1）器皿和容器的处理： 所有待用的烧杯、研钵、试剂、离心管、量筒、枪头、试剂瓶等都用 0.1 % DEPC水溶液在 37 ℃浸泡 24 h。