动物骨髓细胞染色体的制备与观察.docVIP

实验七? 动物骨髓细胞染色体的制备与观察 ???[实验目的] ?? 1. 通过青蛙或小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。 ????2. 熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。 ?? [实验原理] ???? 骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次是要能够清楚的观察染色体的形态。为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。制备优良的标本可获得满意的观察效果。利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。 ??????[实验用品] 1. 动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。 2. 试剂：0.02﹪秋水仙素、0.075mol/l氯化钾 (kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。 3. 器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50ml、100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。 [实验内容与方法] 一、试剂配制 1. 0.02﹪秋水仙素溶液：秋水仙素2mg，灭活生理盐水（蛙类0.65﹪、哺乳类0.85﹪的nacl）10ml溶解，避光保存。 2. 0.075mol/l kc1溶液： 原液： kcl 11.8g双蒸水100ml溶解。 ??? 使用液：原液1份，双蒸馏水19份混合， 3. 吉姆萨 (giemsa)染液： 原液：吉姆萨染粉0.5g，甘油33ml，甲醇33ml，配制时先将giemsa粉置于研体中，加入少量甘油，研磨至无颗粒，再加入余下的甘油，拌匀后放入56℃温箱中保温2小时，然后取出加入甲醇，充分拌匀，滤纸过滤用棕色瓶密封，避光保存，一般要放置2周后才能使用。 ??? 使用液：原液1份，ph6.8磷酸缓冲液9份稀释。使用液不宜长期保存，一般现配现用。 ??? 4. ph6.8磷酸缓冲液：该液可先配成甲液和乙液，然后混合使用。 ??? 甲液：kh2po4 0.907g蒸馏水100ml溶解。 ??? 乙液：na2hpo4·2h20 1.18g（或na2hpo4·12h20 2.38g）加蒸馏水100ml溶解。 ??? 使用液 (ph6.8)：甲液50.8ml，乙液49.2ml混合，该使用液也不易久放，一般也是现配现用。 二、染色体制备 ??? 各种动物骨髓细胞染色体的制备方法基本都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备的过程。 1. 取健康小鼠一只，按每10g体重由腹腔注入含量为0.02% 的秋水仙素0.3ml（此步在实验前12～24小时完成，哺乳动物在实验前2～4小时完成）。 2. 将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。 3. 用剪刀、镊子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结，迅速用5ml注射器抽取0.075mol/l的kcl溶液，从一头插入骨髓腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，直至骨髓腔变白。此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用镊子或吸管取出。加低渗液至5ml或8ml刻度，放入37℃恒温水浴箱内低渗处理25分钟。 4. 低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3﹕1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。1～2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平，使两支管的重量相等，然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1 500r/min 离心5～8分钟。 5. 取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6～8ml，用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37℃水浴箱中固定15～20分钟。 6. 再取出离心管，配平后离心5～8分钟，转速同样为1 500r/min。离心完毕，去掉上清液，再加入1ml左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。 7. 取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从30cm左右的高度滴到载玻片上，再用口吹散