鸡传染支气管炎病毒H52株、H120株与M41株分子生物学鉴别方法的的研究.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 鸡传染支气管炎病毒H52株、H1 20株和M41株分子生物学鉴别方法的研究 于静，杨承槐，李俊平，李启红，刘丹，夏业才2蒋桃珍，李慧姣 (中国兽医药品监察所，北京，100081) M41株； 设计并合成了两对特异性引物，其中A引物能以M41株模板，特异性扩增出1791bp的目的片断，从而特异鉴定IBV 另一对B引物能以H52株和H120株为模板，特异性扩增1700bp的目的片断，再用限制性内切酶NaeI对PCR产物进行酶切， 究建立的方法和技术具有快速、简单、特异等优点，进一步完善了种毒特异性检验方法，为IBV活疫苗的分子鉴别检验奠定 基础。 关键词：鸡传染性支气管炎病毒；特异性引物；鉴别 Infectious 鸡传染性支气管炎(Avian BronchitisVirus，IBv)引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病…，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖 和消化系统等瞳1，其特征症状为病鸡咳嗽、喷嚏、气管罗音；幼鸡流鼻液；蛋鸡产蛋数量和品质下降，是严 重危害养禽业的主要传染病之一。传染性支气管炎病毒易发生变异，分型复杂，不同毒株在毒力、致病性 和组织嗜性上存在很大差异口3。疫苗免疫是当前预防和控制鸡传染性支气管炎的主要措施，一些毒株用传统 的种毒鉴定方法很难准确鉴别，尤其是血清型相同，但基因型不同的毒株更难鉴别。针对IBV易变异H1，种 毒种类多，一些毒株不易通过血清学方法准确鉴别畸1等特点，有必要采用分子生物学技术哺。，对IBV序列中 差异较大的序列进行分析，建立传染性支气管炎病毒的分子生物学鉴别方法，进一步完善特异性检验方法。 1材料与方法 1．1 毒种 株以及新城疫病病毒LaSota株、鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存。 I为大连宝生物公司产品；PCR产物纯化试剂盒为天根生化科技公司产品。 公司产品，限制性内切酶Nae 1．3引物设计 1．3．1 计一对引物： M-H(+)：AGAAGAATGTGACACGGATTC M-H(一)：GAATATTGCGTTTTAA从TGT 能从M41株基因组中特异性扩增出长度为1791bp片断，而不能扩增H52株和H120株。 1．3．2引物B的设计参照发表的H52株和H120株的全基因组序列，设计了一对引物： NaeI (+)：ATTACTTTAAATACTTGTGTT NaeI (一)：GGCATATACATATCTCGTGCA I，而H52扩增片段中无此位点，因此利用限制性内切酶NaeI可以区分H52株和H120株。 酶切位点Nae 基金项目：科技部科技基础性工作专项“重大动物疫病病原及相关制品标准物质研究”(2008FYl30100)；中国兽医药品监察所所级课题“鸡传染性支 气管病毒种毒的分子生物学鉴定”(201004) 作者简介：于静，硕士研究生．从事禽病毒研究 通讯作者：杨承槐，yangchenghuai@ivdc．gov．cn；夏业才，xiayecai@ivdc．gov．cn 病毒 1 4病毒RNA、洲^的提取参照OME6A公司产品说明书．提取病毒RⅥ和DNA。 1 5 RT—PCR 1．5 1反转录在20uL体系中进行，按InvitrogenM-MLV反转录酶的说明书进行。 l 52 PcR 在25¨L体系中进行： 2 u uI，， 3uL，lOXBuffer25IJL，dNTPuL．L游引物1L，F游引物1 反应管中依次加入ddth016 pL，Ex 2uL。 反转录产物2 Taq酶0 反应在95℃预变t牛5mirl，然后按以下参数； 变性：94Clmin；退火：500℃(A