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基因测序技术基础原理 DNA 序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger 双脱氧链终止法和 Maxam-Gilbert 化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA 序列分析的主流。美国PE ABI 公司已生产出373 型、377 型、310 型、3700 和3100 型等DNA 测序仪，其中310 型是 临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310 型DNA 测序仪的 测序原理和操作规程。 【原理】ABI PRISM 310 型基因分析仪( 即DNA 测序仪) ，采用毛细管电泳技术取代传统的 聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法) ，因此 通过单引物PCR 测序反应，生成的PCR 产物则是相差 1 个碱基的3末端为4 种不同荧光 染料的单链DNA 混合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细管内电泳，从 而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细 管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的 CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅 分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD 摄影机上同步成像，分析软 件可自动将不同荧光转变为DNA 序列，从而达到DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电 泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA 片段的 碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE 公司还提供凝胶高分子聚合物，包括 DNA 测 序胶(POP 6)和GeneScan 胶(POP 4) 。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序 精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh 电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。 电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD 摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR 片段大小分析和定量分析为 10～40min 。 由于该仪器具有DNA 测序，PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA 测序、 杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP) 、微卫星序列分析、长片段 PCR 、RT-PCR( 定量 PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA 测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基 因突变检测、HLA 配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 【试剂与器材】 1．BigDye 测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE 专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP ，AmpliTaq DNA polymerase FS ，反应缓冲液等。 2 ．pGEM -3Zf (+) 双链DNA 对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21) 引物 TGTAAAACGACGGCCAGT ，3.2 μmol/L ，即 3.2pmol/ μl，试剂盒配套 试剂。 4 ．DNA 测序模板 可以是PCR 产物、单链DNA 和质粒DNA 等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量 1 μl 为宜。本实验测定的质粒DNA ，浓度为0.2g/L ，即200ng/ μl 。 5．引物 需根据所要测定的DNA 片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2pmol/ μl 。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21) 引物，T7 引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml 或和0.5ml 的PCR 管 盖体分离，PE 公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc ·3H2O 溶于70ml 蒸馏水中，冰醋酸调pH 至5.2， 定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/ 乙醇混合液 取37.5ml 无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc 混匀，室温可保存1 年。 11．POP 6 测序胶 ABI 产品。 12．模板抑制试剂(TSR) ABI 产品。 13．10×电泳缓冲液 ABI 产品。 14．ABI PRISM 310 型全自动DNA 测序仪。 15．2400 型或9600 型PCR 仪。 16．台式冷冻高速离心机。 17．台式高速离心机或袖珍离心机。 【操作步骤】 1．