非标记寡核苷酸作为内标融解温度对照品用在基于扩增子融解分析的基因分型.pdfVIP

非标记寡核苷酸作为内标融解温度对照品用在基于 扩增子融解分析的基因分型 提示：扩增子融解分析是一种毋需探针的基因分型或等位基因特异性分析的闭管实时多聚酶链反应。 然而，通过解链温度（Tm ）正确区分纯合子突变体和野生型样本则需要高分辨率的融解分析并严格控制反 应条件。当用3 种不同的DNA 提取方法从全血中分离DNA 时，扩增子0.03 ～0.39 ℃的Tm 差别是由于提取 方法不同所致。为校正样本间的溶液化学的差别，互补的非标记寡核苷酸作为内标融解温度对照品配置在 体系中以转移和标刻衍生融解图的温度轴。这种调整用于一种二重扩增子融解测试亚甲基四氢叶酸还原酶 1298A→C 和677C →T 的变异体。涵盖扩增子融解区域的高融解温度对照品和低融解温度对照品在纯合子 基因分型中可致Tm 值的SD 降低47% ～82%。当内标融解温度对照品配置在体系中时，扩增子融解测试与 相近的杂交探针融解测试 100%吻合；但若无内标融解温度对照品的校正，则两者存在3%的错误率。总之， 内标融解温度对照品增加了藉高分辨率扩增子融解分析进行基因分型的精确度并且能改善在低分辨率仪器 上进行融解分析的结果。 扩增子融解分析是一种简单的闭管基因分型的方法，后者用一个饱和的 DNA 结合染料 取代荧光标记的引物或探针。高分辨融解分析在单重或多重 PCR 中能检测单碱基改变和其 他变异。野生型和纯合子突变样本具有典型的、锋利而对称的融解曲线改变，而杂合子样本 则具有更复杂坡度的融解曲线。纯合子序列的改变导致特征性的解链温度的移位，相反，杂 合子样本通过融解峰形状和宽度而非 Tm 值的改变来确定。通过扩增子融解分析正确鉴定样 本的基因型，需要反应条件的标准化以便获取可重复性的特征性的融解图谱。许多 PCR 试 剂之间的反应条件可能不尽相同，包括不同的 DNA 提取方法所引入的缓冲液，尤其是离子 强度会显著影响 Tm 值。 本研究引入 1 个或多个用于反应之间融解温度校准的内标对照品。所幸的是，这种并不 干扰 PCR 的非标记寡核苷酸的特殊设计使得其本身的融解处在PCR 产物的融解温度范围以 外。任何影响二重子 Tm 值的缓冲液的差别将同时影响扩增子和作为内标融解温度对照品的 非标记寡核苷酸两者，因而使得后续融解图谱温度的校正成为可能。亚甲基四氢叶酸还原酶 1298A→C 和 677C→T 的基因变异作为基因分型的靶点用于本研究，将单色的二重扩增子融 解测试（分别使用和不使用内标融解温度校正）的结果与二重多色杂交探针融解测试的结果 进行比较。 1 材料与方法 1.1 DNA 提取和实验设计 60 例全血样本提供给 ARUP 研究所做亚甲基四氢叶酸还原酶 1298A→C 和 677C→T 基 因型的临床评估，该全血用 K3 乙二胺茶碱四乙酸、肝素钠、或枸橼酸-磷酸-右旋糖作抗凝 处理。样本根据全球 ARUP 协定（公共考察委员会第 7 275 号）进行设盲和解密。DNA 用 Roche MagNA Pure LC 系统提取，经 A260 吸光率测试计算，可达 20～40 ng/μl 的浓度。所 有样本经二重多色杂交探针融解测试进行基因分型。依据基因型选择其中 37 份样本同时作 二重扩增子融解测试。对这些样本进行设盲，分别不用融解温度校正、仅用低融解温度校正、 仅用高融解温度校正或用低温和高温两者进行校正以确定基因型。单侧 F-检验用于评估纯 合子基因型 Tm 值的变异。 通过 3 种方法[分别为：①Roche MagNA Pure LC system(Roche) ；②Puregene DNA blood kit(Gentra Systems Inc.,Minneapolis,MN) ；③Qiagen QIAamp DNA blood mini kit(Qiagen Inc., Valencia,CA)]提取另外 10 例全血样本的 DNA 。QIAamp 和 MagNA Pure 提取的 DNA 样本， 可达 20～40 ng/μl 浓度，不经稀释直接用于实验；而经 Puregene 提取的 DNA 可达 160～500 ng/μl 浓度，实验前须稀释至 40 ng/μl. 。上述 DNA 进行二重扩增子融解测试，提取方法对 Tm 值的影响通过配对 t 检验进行评估。每种提取方法以及经过内标低融解温度对照品和内 标高融解温度对照品处理前后的 Tm 值之间的平均差别也经计算获得。 1.2 亚甲基四氢叶酸还原酶（1298A→C 和 677C