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筛选棉花抗黄萎病相关基因Ve候选克隆及分析 ＊ 杨硕，王省芬，马峙英 ，张桂寅 河北省作物种质资源重点实验室，河北农业大学，河北保定 （071001 ） E-mail ：mzhy@ 摘 要：根据番茄中已克隆出的抗黄萎病 Ve 基因在NCBI 上Blast 比对结果，设计一对特 异性引物，扩增出棉花的一段 EST 。本试验采用混合池PCR 方法，对优质、抗病海岛棉 品种Pima90-53 BAC 文库进行筛选，最终从 110,976 个BAC 克隆中筛选到含有 Ve 基因片 段的 3 个阳性克隆，分别为277J9 、277K7 和277K8 。用Sau3AI 对其中的 277K7 克隆进 行酶切，构建亚克隆文库，并用特异性引物继续筛选为克隆 Ve 基因奠定了基础。研究表 明，混合池PCR 法对克隆数目巨大的基因组文库的筛选很有效。 关键词：棉花；黄萎病；BAC 文库；Ve 基因；混合池PCR 中图分类号：S562.032 1. 引言 黄萎病（Verticillium wilt ）是一种由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae ）和黑白轮枝菌 （Verticillium albo-atrum）引起的土传维管束病害，在世界各地引起许多重要经济作物如 陆地棉（Gossypium hirsutum）、茄子（Solanum melongena ）、番茄(Lycopersicon esculentum) 、 马铃薯（Solanum tuberosum ）和甘蓝（Brassica chinensis ）等发生黄萎病[1-5]，严重影响了 这些作物的产量和品质，至今尚未从根本上解决，因此，挖掘植物抗黄萎病相关基因并将 之应用于育种可能是解决上述问题的有效途径。 目前，关于棉花等植物抗黄萎病基因定位和抗病基因克隆的报道很少。在番茄中， Kawchuk 等[6-8]分离到抗黄萎病基因家族的2 个成员基因 Ve1 和 Ve2 ，将之转化马铃薯后， 成功提高了马铃薯抗黑白轮枝菌的能力。BAC 文库是分析、分离特定基因表达的有利工具， 其大片段DNA 包括了编码区、内含子和调控区[9] 。本研究根据番茄中Ve1 基因在NCBI 上的Blast 比对结果，设计一对特异性引物，扩增棉花的一段EST ，采用混合池PCR 技术 筛选课题组构建的抗病优质海岛棉品种Pima90-53 BAC 文库，以获得含有抗黄萎病 Ve 基 因的BAC 克隆，为进一步克隆抗黄萎病 Ve 基因奠定重要基础。 2. 材料与方法 2.1 供试材料 海岛棉品种Pima90-53及其BAC文库均来自河北农业大学棉花遗传育种研究室，感受态 细胞大肠杆菌DH5α和克隆载体pUC118BamHI/BAP 分别为天为时代公司和TaKaRa 公司产 品。 2.2 试验方法 2.2.1 EST序列的获得和特异引物设计 根据番茄中已克隆的抗黄萎病 Ve1 基因在NCBI 上BLAST 比对结果，设计一对特异性 引物，序列分别为：CESTF ：5 ＇GGAGTATCCCTGAGTCGATATGCA3 ＇；CESTR ： 本课题得到国家973 项目（2004CB117302-1 ）、国家自然科学基金）、教育部重点科技项目（204017 ） 的资助。 - 1 - 5 ＇CACTTCTGGTATTGGCCC3 ＇。以50ng 海岛棉品种Pima90-53 基因组DNA 为模板， 进行PCR 扩增。扩增反应总体积为20uL ，包括：10×PCR buffer(含Mg2+) 2.0µL ，2.5mM dNTP 1.6µL，Taq 酶(2.5U/µl) 0.2µL，正向引物(10uM) 1µL，反向引物(10uM) 1µL，模板DNA 1µL ， 用ddH2O 补至20µL 。反应条件为：94℃ 5min ；94℃ 45s ，62℃ 45s ，72℃ 1min ，5 个循环； 94℃ 45s ，60℃ 45s ，72