应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA方法.pdfVIP

中国农业科学 2006,39(1):181-186 Scientia Agricultura Sinica 应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接 ELISA 方法 1 1 1 1 2 辛九庆 ，高玉龙 ，李 媛 ，王砚范 ，钱爱东 1 2 ( 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所／国家牛传染性胸膜肺炎参考实验室，哈尔滨 150001 ； 吉林农业大学动物科技学院，长春 130118) 摘要：【目的】丝状支原体丝状亚种 SC（Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC，MmmSC）是引起牛传染 性胸膜肺炎（contagious bovine pleuropneumonia，CBPP）的病原体。成熟的脂蛋白 LppQ N 端是亲水性的，在 自然感染和人工感染时，特异性免疫反应产生早，持续时间长，抗体滴度高，因此有理由相信脂蛋白LppQ N端片 段将有可能成为一种理想的 CBPP 诊断抗原。【方法】由于 TGA 密码子在支原体中编码色氨酸（Trp），而在细菌中 则为终止密码子，故利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRI Ⅹ的 lppQ 基因进行原核 表达，利用重组抗原建立间接ELISA方法。【结果】序列分析表明，将lppQ 基因第198 位的A成功突变为G， 并 将突变后的脂蛋白 LppQ N 端基因片段插入原核表达载体 pET32a 的多克隆位点，构建了原核表达载体。重组菌经 诱导后，表达出了分子量约为42 kD、带有 6个组氨酸标签的重组融合蛋白，纯化后蛋白质纯度高达95%，Western blot 结果显示，重组蛋白具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至 0.35 µg·ml-1 ，包被酶标反应板，优化反 应条件，P/N为 4.8（0.934/0.193）。应用TG-ROC统计软件分析确定阴阳性血清临界OD值为 0.376，敏感性为95.8% （46/48）， 特异性为 98.9%（161/163）。应用间接 ELISA 和补体结合试验（CFT）对来自 3 个省自治区 3 817 头 份牛血清进行了检测。【结论】Kappa值为0.63，两种方法存在中、高度一致性。 关键词：牛；牛传染性胸膜肺炎；脂蛋白LppQ；突变；ELISA Development of an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Contagious Bovine Pleuropneumonia Using Recombination Lipoprotein LppQ of Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC 1 1 1 1 2 XIN Jiu-qing ，GAO Yu-long ，LI Yuan ，WANG Yan-fan ，QIAN Ai-dong 1 ( National Reference Laboratory of Contagious Bovine Pleuropneumonia, Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001; 2College of Animal Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118) Abstract: 【Objective 】Mycoplasma mycoides subsp mycoides SC (MmmSC) is the etiological agent of con