犬精液品质的荧光染色评价方法.pdfVIP

·- — — 240．—— 江苏农业科学 2011年第 1期 张 斌，李 玲，武彩红，等．犬精液品质的荧光染色评价方法[J]．江苏农业科学，2011(1)：240—242 犬精液品质的荧光染色评价方法 张 斌 ，李 玲。，武彩红 ，翟小虎 ，李锦强 ，蒋 翔 (1．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州 225300；2．江苏姜曲海种猪场，江苏泰州 225300) 摘要：为了探索荧光染色技术在犬精液品质检测中的应用，将犬精子标记相应的荧光染料 ，用荧光显微镜观察精 子的质膜完整性 、线粒体活性与顶体完整性。在荧光显微镜下，死精子经PI染色后，头部核区呈红色 ；具有活性线粒 体的精子经 Rh123染色后，尾部中端线粒体部分呈现绿色荧光 ；顶体完整的精子经FITC—PNA染色后，顶体区可见绿 色强荧光。说明PI染色 、Rh123染色及FITC—PNA染色分别用于评价精子质膜完整性、线粒体活性和顶体完整性，是 评价犬精液质量的有效方法。 关键词 ：犬；精液品质；荧光染色 中图分类号 ：$829．2 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2011)O1—0240—02 精子作为一种复杂的终端细胞，它的品质对于受精能力 果糖 0．2522g、MgC12 ·6H2O 0．102g、CaC12 ·2H2O 及胚胎发育具有重要影响。特别是随着体外受精技术、人工 0．0147g溶解于 100mL蒸馏水 中)中加入 2 碘化丙啶 授精及精液保存等技术发展，对精液品质准确、客观地评价显 (P10．025g溶于 10mLPBS中)，再加入精液悬液 50 ， 得尤为重要。传统的精液品质评价主要以精子活力、存活率、 37℃孵育30rain，取 lO L精液悬液滴于载玻片中央，再滴 存活时间、存活指数、热抗力、精液成分、精细胞内酶活性和一 加少量抗荧光淬灭剂DABCO[10mL甘油／PBS(9：1)溶液中 些形态学特征为指标，存在费时、主观性强及各方法之间相关 含DABCO0．02468g]，盖片，无色指 甲油封片，在荧光显微 性低等缺点…，且检测方法和指标不能反映精子的内部结构 镜(T1一SM，Nikon)下观察、拍照。 和功能 J。近年来，荧光染色技术评价精液品质迅速发展。 1．2．2 线粒体活性评价(Rh123染色) 100 HEPES中加 荧光染料可直接或间接地发出荧光，从而借助荧光显微镜或 入2p．LRh123溶液 (0．O05gRh123溶于 1mLDMSO中)， 流式细胞仪进行检测，具有全面、准确、简便等特点，且能充分 37℃孵育 10min，然后再加入精液悬液5O ，37℃孵育 反映精子的结构和功能状态，已应用于猪 、人 、猕猴 。等 30min，取 10 精液悬液滴于载玻片中央，再滴加少量 精液质量评价 ，但犬精液品质评价 的相关文献非常有限。因 DABCO，盖片，无色指 甲油封片，荧光显微镜下观察、拍照。 此，笔者以犬精液为试验材料，以精子质膜完整性、线粒体活 1．2．3 精子顶体完整性评价 (FITC—PNA染色) 0．5mL 性与顶体完整性为评价 目标，探讨荧光染色在犬精液品质评 精液在 1mL丙酮(一20oC下预冷)中4℃固定 5min，500g 价中的应用。 离心6min，弃上清液；沉淀用PBS(pH值 7．2)洗 2次，然后 用HEPES／BSA封闭30min，再加入异硫氰荧光素标记的花 1 材料与方法 生凝集 素 (FITC—PNA，0．001g溶解 于 10mLPBS中， 1．1 犬精液采集 一 20℃避光保存)50 ，于 37℃孵育 30min，500g离心 利用手握法采集贵宾犬精子，立即置于保温桶中，1h后 6min，弃上清液；沉淀再