茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的实验研究.pdfVIP

茶多酚对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的实验研究1 1 1 2 3 武红莉 ，陈信义 ，韩冷 ，崔巍 1 北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京（100700 ） 2 苏州大学生命科学学院，江苏苏州（215007 ） 3 教育部、北京市重点实验室（中医内科学），北京（100700 ） E-mail ：chenxinyi0729@ 摘 要：目的：观察茶多酚（TP ）对体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC ）增殖的和凋亡 的影响。方法：倒置相差显微镜、RT-PCR 法进行HUVEC 的观察及鉴别。应用MTT 法和 流式细胞仪测定不同浓度TP （1、10、100µg/ml ）对HUVEC 增殖、细胞周期、增殖指数及 凋亡率的影响。结果：目的条带测序结果与GenBank 人CD31 基因序列完全一致。10、100µg/ml TP 能抑制HUVEC 增殖（P0.01 ）。100µg/ml TP 与对照组相比：细胞增殖指数PI 降低，G1 期细胞增加，S 期细胞减少，G2 期细胞减少，凋亡率显著增加（P0.05 ）。结论：TP 能抑 制内皮细胞增殖并诱导其凋亡，是一种潜在的新生血管抑制剂。 关键词：茶多酚；人脐静脉内皮细胞；细胞增殖；凋亡 内皮细胞分裂与增殖是肿瘤血管生成的物质基础，因而成为抗血管生成研究课题中的主 要对象之一。已有研究表明茶多酚可抑制肿瘤的血管生长，本实验以HUVEC为模型，研究 茶多酚对血管内皮细胞增殖与凋亡的作用，以探讨茶多酚对血管生成作用及其机制。 1 材料 1.1 受试样品及试剂 茶多酚（tea polyphenol,TP ）：江西绿康天然产物有限责任公司惠赠，纯度98%，临用前 用三蒸水配制成100mg/ml母液，再用完全培养液稀释成各种实验浓度；噻唑兰（MTT ）粉、 Rnase 、碘化丙啶（PI ）：Sigma公司产品，临用前PBS配制成5mg/ml；DMEM高塘培养基、 胎牛血清(FBS)：GiBCO公司产品；二甲基亚枫（DMSO ）：国产分析纯。 1.2 细胞株 人脐静脉内皮细胞（中国典型物种保藏中心CCTCC ）李梢老师惠赠，培养于含10%胎 牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml的DMEM高糖培养液（完全培养液）中，于37℃、 5%CO2条件下培养。 2 方法 2.1人脐静脉内皮细胞的鉴定 用倒置相差显微镜观察细胞形态和生长情况。采用RT-PCR 对HUVEC 进行鉴定。引物 的设计与合成：根据检索NCBI 数据库提供的CD31 基因的cDNA 编码序列（NM_000442.3 ） 进行了PCR 引物设计。其序列为：①上游引物：5 CACCAAGATAGCCTCAAAGTCGG 3； ②下游引物：5 CACCTTCACCCTCAGAACCTCAC 3。目的基因的扩增与纯化按说明书 步骤操作，抽提培养5 天的细胞总RNA 。RT-PCR 反应条件为42 ℃45 分钟，94℃3 分钟， 94℃预变性3 分钟，以94℃变性30 秒，56℃退火40 秒，72℃延伸59 秒，35 个循环后，再 于72℃延伸7 分钟。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收目的条带，送英俊基因公 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（编号）的资助。 - 1 - [1] 司测序 。 2.2 MTT法检测TP对细胞生长的抑制作用 3 取对数生长期的HUVEC于96孔板接种4×10 /孔，培养24h后加入1、10、100µg/ml 3个浓 度的TP及完全培养液的对照组，每组6个复孔，继续培养48h后吸弃上清，每孔加入不含血 清的DMEM培养液200µl及5mg/mlMTT液20µl ，再培