用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断研究进展.docVIP

用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断研究进展广西右江民族医学院附属医院儿科　 　目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、 绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等，虽然诊断精确度较高，但易导致流产等并发症，只能在高危孕妇中实施；后者的优点是既能行产前诊断又无危险性，适用于低风 险的孕妇大群体筛选，尽早发现和杜绝异常胎儿，达到优生目的。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断即是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一，近年来 研究十分活跃，临床医师应注意这一领域的进展。一、孕妇外周血胎儿细胞的类型　　1893年已证明孕妇的肺循环 中有滋养叶细胞存在，以后陆续有报道孕妇外周血中其他类型的胎儿细胞的存在。孕妇血中胎儿细胞的主要类型包括滋养叶细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、有 核红细胞(NRBC)等。直到1969年才考虑到将孕妇血中胎儿细胞作为产前遗传病诊断的材料［1］。　　滋养叶细胞虽因其形态大易于鉴别，但在 早孕母血中含量极少且迅速陷于肺组织中更使其在孕妇周围血含量更微，再者其所含染色体并非总是与胎儿相符，是因其多核特点及其与胎盘的嵌合现象所致，所以 滋养叶细胞不是理想的产前诊断细胞。胎儿淋巴细胞用作产前诊断有相当的潜力，因其表达HLA抗原，故当父母的HLA不同时，更易分离、鉴别与富集，但当父 母HLA相同时则无特异性的鉴别与分类、富集方法；但胎儿淋巴细胞产生太迟(孕中期)，失去早期诊断意义；另外胎儿淋巴细胞在孕妇血中生存期长，达数年或 更长，易造成误诊(多次妊娠者)，因此胎儿淋巴细胞也不是最理想的产前诊断材料。其他的白细胞如粒细胞、单核细胞等研究得不多，特异性也不高。目前认为最 合适作产前诊断的胎儿细胞类型当首推胎儿有核红细胞，理由是：(1)胎儿有核红细胞是单核的，孕早期胎儿血中含量丰富但孕妇外周血中罕见；(2)其表达几 种特异的抗原如运铁蛋白受体和特异的胎儿血红蛋白肽链如ζ链和γ链，作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和富集；(3)其在孕妇外周血中的生存期短，不会 持续到下一次妊娠。但值得注意的是早孕期孕妇外周血的有核红细胞大都是孕妇本身产生的［2，3］。二、胎儿细胞的富集、鉴别及分析技术　 　由于孕妇血中胎儿细胞的数量太少，大约是孕母血细胞的1/105～1/109［4］，必须进行分离纯化才能利于进一步分析、作产前诊断。目前，分离胎儿 细胞有多种手段，主要包括密度梯度离心、流式细胞分类计、磁激活细胞分类(MACS)、荧光激活细胞分类(FACS)、选择性细胞培养技术、尼龙毛柱分离 法、单独溶解红细胞法等。　　Johansen等［5］分别采用5种不同的方法对滋养叶细胞进行分离的研究表明，单独溶解红细胞法是获得滋养叶细 胞的最好途径，当与Ficoll密度梯度离心法联用时则获得的纯度低且费时。FACS尽管富集力强(3250倍)且纯度高，但收获率低(8%)。外包裹有 抗CD16抗体的免疫滋珠法是进行滋养叶细胞免疫细胞化学特征研究的最好方法。包裹有CD45抗体的IO珠法是分离用于产前诊断的滋养叶细胞最常用的方 法，因其纯度高，富集能力强(32倍)且收获率高(78%)。Wachter等［6］用电荷流式分类(CFS)法对16例孕妇(怀男婴13例、Downs 氏综合征2例、18三体死婴1例)外周血样进行初步分离，发现每20ml血样中平均有2000个胎儿NRBC，均经与染色体的荧光原位杂交(FISH)证 实。Bianchi等［7］应用针对胎儿红细胞抗原即运铁蛋白受体(CD 71)、thromfospondin受体(CD 36)和血型糖蛋白A(GPA)的三种不同的单克隆抗体方法作为荧光激活细胞流式分类。结果表明用抗CD 71或CD 36鉴别出胎儿性别的精确度分别为57%和88%，而用抗GPA分离的细胞预报胎儿性别的正确率为100%。Steel等［2］开发了一种快速、价廉的简 易技术从孕妇周围血中富集红细胞，其原理是在初步消除孕妇血中的单核细胞后接着进行阳性选择。其程序为收集早期或中期孕妇周围血，通过 Ficollhypaque密度梯度离心分离得单核细胞(包括有胎儿有核红细胞)混悬液，然后用抗CD 45/抗CD 14的混合剂(与孕妇血中的大部分单核细胞起免疫反应)处理，接着加入粘附于含铁胶粒的山羊抗鼠IgG，并形成含铁的非有核红细胞及单核细胞，在磁场的作 用下这些细胞被吸引住并将其弃除，余下有核红细胞。最后一步是有核红细胞的阳性选择。首先加入CD 71抗体，然后象上述一样加含铁溶液，再次混合并放置于磁场中，此时，粘附于磁极大多是有核红细胞，洗净后将其从磁极中移开即可进行FISH分析。 Simpson等［8］在研究持续流式方法及其敏感性、特异性