细胞生物学实验课3细胞传代与冻存.pptVIP

细胞生物学实验 张 伟 实验三、细胞的传代培养与冻存 传代中的 “代”与细胞世代中的 “代”不同 传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。 悬浮型细胞。 半贴壁细胞 （四）细胞传代后的四个生长阶段 潜伏期：细胞无分裂，6-24小时。 指数生长期：细胞增殖最旺盛时期，分裂相细胞的比例（分裂指数）。 停滞期：细胞数量达到饱和，细胞停止增殖，但仍有代谢活动。平台期。 衰退期：自然衰退和耗竭衰退。 （五） 何时传代与如何传代？ 贴壁生长细胞传代 弃掉培养液，加0.5～1mL的胰酶涮洗一下培养瓶，去残留的旧培养液，解除血清对胰酶的抑制作用。 每瓶细胞加入1mL胰酶, 盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞突起收回变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶去掉。注意勿使细胞提早脱壁落入消化液中。 加入5ml的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液计数然后分装到新培养瓶中(1x105/ml ，5mL/小瓶） 。盖上瓶盖, 适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 细胞消化的最佳程度 悬浮细胞传代步骤 可将细胞培养悬液进行离心去除旧培养液上清，加入新鲜培养液，然后分装到各瓶中。 冷冻保护剂的种类及作用机制 常用渗透性冷冻保护剂主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。 DMSO：对细胞无毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。常用浓度为5%-10%，细胞在液氮中冻存1-2年，存活率可达80%-90%。DMSO液需预先用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞 三、实验材料及设备 1. 细胞 人宫颈癌HeLa 细胞 人胃癌BGC-823细胞 中国仓鼠卵巢CHO细胞 2. 试剂 DMEM培养基、胰酶、血清、DMSO、抗生素 3. 仪器 超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜 4.其它用品： 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯 5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。 6.将培养液瓶（90mL) 过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7. 打开血清瓶（10.5mL) ，瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 8. 无菌吸取10mL血清加入到培养液（90mL)中，用微量移液器加入双抗200μL轻轻混匀，配置完全培养基。 9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培养基轻轻混匀，加入0.5mL DMSO（冻存保护剂），轻轻混匀即为冻存液 。 思考题 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤? 2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同? 4.如何估计是否传代和传代的方式? 5.细胞冻存应注意的问题。 * * 1.细胞培养中为什么NaHCO3？ 2.细胞培养中为什么添加血清？ 3.消化液胰酶的浓度是多少？ 一、实验原理 （一）传代培养 1.传代培养的概念 当原代培养细胞或已成为细胞系的细胞，增殖达到一定密度后，将培养的细胞从一个容器以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，称为传代培养或继代培养。 2. 细胞传代的意义与目的 防止细胞增殖过度、营养枯竭、酸中毒 维持细胞种的延续。 利用培养细胞进行各种实验。 3. 需要注意的两个问题 （二）培养细胞的种类 贴壁细胞：附着在一个固相支持物表面才能生长的细胞。如大部分的上皮来源的细胞。单层细胞，接触抑制。 半贴壁细胞：呈现贴壁生长现象，但不牢。 悬浮细胞：不需附着在固相支持物表面，悬浮即可生长的细胞。如血细胞等。 贴壁细胞 （三）细胞贴壁过程 培养细胞一代生长过程 1. 肉眼观察——培养物颜色及混浊度 2. 倒置显微镜观察细胞生长状态 意义：为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存（保种）。运送等 条件：冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，短时间可以存放在-80