人IL-6基因克隆及其在原核生物中表达及条件优化.pdfVIP

生物技 术通报 - 研 究 报 告 · 8loTECHN0L0GY BULLETIN 2010年 第 5期 人 IL．6基因的克隆及其在原核 生物中表达及条件的优化 史继静 刘朝奇 杨凡 杨祖伟 (三峡大学分子生物 学研究所 ，宜昌 443002) 摘 要 ： 构建人 白细胞介素6(IL一6)的原核表达载体并优化其表达条件 ，为 IL一6的高效表达提供试验依据。以人 T细 胞 cDNA为模板通过 PCR方法扩增 IL一6基 因，将其克隆到原核表达载体 pET28a(+)中，酶切及测序鉴定重组体。将构建好 的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用 IPTG进行诱导表达 ，产物用 Westernblotting及人 IL一6检测试剂盒分析鉴定 。在保 持菌种不改变的前提下，分别改变 IPTG的浓度 、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化 IL-6表达条件 。结果显示，原核 表达载体 pErI’28a(+)一IL-6成功构建，可在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达 ，得到相对分子质量约 22kD的 IL一6蛋 白，经 Westernblotting鉴定正确 ，经人 IL一6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在 IPTG浓度400p．mol／mL，卡那霉素浓度 5O g／ mL，40℃培养 6h的条件下，目的蛋 白表达量最高，可 占总蛋 白表达量的40％。成功构建人 IL一6原核表达载体且获高效表达， 为研 究IL-6生物学活性及产品开发提供 了试验基础 。 关键词 ： IL一6 原核表达 条件优化 CloningofHuman Interleukin-6GeneandtheOptimized Expression ConditioninProkaryotes ShiJijing LiuZhaoqi YangFan YangZuwei (InstituteofMolecularBiology，ThreeGorgesUniversity，Yichang443002) Abstract： Thestudywasdesignedtooptimizehumaninterleukin一6(IL一6)expressioninprokaryotesforthehigheffectiveexpres- sion．ThefulllengthgenefragmentofhlL一6wasamplifiedbyPCR，andthenclonedintoprokaryoticexpressingvectorpE~8a(+)． TherecombinantproteinIL一6wasinducedbyIPTGinE．coliBL21(DE3)andtheexpressedproteinwasdetectedbyWesternblotas— sayandELISA．Through changingtheconcentrationofIPTG andkanamycin，lengthoftimeinducedbyIPTG，andcultured temperature tooptimizeIL-6expression．ResultsindicatedthattheplasmidpET28a(+)一IL一6wassuccessfullyconstructedandhlL一6proteincould beexpressedinE．coliBL21(DE3)．TherecombinantproteinwascharacterizedbywesternblottingandELISA．Throughoptimizing， thesatisfactoryexpressionconditionwasobtained，asfollow includingIPTG concentration400 txmol／mL；inducedtimeof6hours；kana· mycin50~g／mL；culturedtemperature