黄曲霉素M1试剂盒说明书1.docVIP

概述 黄曲霉素是霉菌的产物，高毒性并致癌。黄曲霉素M1不是微生物而是在动物体中由黄曲霉素B1转化形成的。当奶牛食用有黄曲霉素B1污染的饲料后，通过消化和分泌，黄曲霉素就会转化为羟基化的黄曲霉素M1，绝大部分分泌到乳汁中。因此，黄曲霉素M1浓度反映了饲料中黄曲霉素B1的含量。欧盟对奶中的黄曲霉素M1限量是0.05ppb（50ppt）。 用竞争酶联免疫分析法检测生物样本中的黄曲霉素M1。所有酶联免疫分析的试剂包括标准品都由试剂盒提供。 检测数量：96孔（含标准品孔） 检测时间：20分钟 原理 分析在包被有黄曲霉素M1抗体的聚苯乙烯微孔中进行。黄曲霉素M1标准溶液和样品加入微孔，在温浴过程中，游离的黄曲霉素M1分子与抗体结合，没有结合的物质在清洗步骤中被清洗，第二次温浴时已经加入HRP-黄曲霉素M1酶标物，它将没有结合的抗体位点全部覆盖。通过加入基底物质可以确定酶活性，第三次温浴时酶将无色的显色剂转变成一种蓝色，加入终止液使蓝色变成黄色，用酶标仪在450nm测定吸光度，通过颜色深浅不同换算成黄曲霉素M1的浓度值。 应用范围 黄曲霉素M1ELISA试剂盒用于定量检测牛奶和奶酪中的黄曲霉素M1。 提供的试剂 1、微孔板：96孔（12×8，可拆卸） 2、酶标物：冻干粉一瓶 3、酶标物稀释液：13ml一瓶 4、样品稀释液：一瓶（使用时加入40mL双蒸水充分溶解后使用） 5、清洗液（10×）：50ml一瓶 6、显色剂：13ml一瓶 7、终止液：13ml一瓶 8、黄曲霉素M1标准品溶液：6×1ml/瓶（0ng/mL，0.005ng/mL，0.03ng/mL，0.15ng/mL，0.5ng/mL， 2ng/mL） 试剂盒未提供的材料 1、10-1000 ul不同规格的微量移液器 2、50-300ul多道移液器 3、酶标仪（有450nm滤光片） 4、离心机（如果离心速度低最好使用低温离心机） 5、带盖试管 6、涡旋振荡器 7、正己烷 8、二氯甲烷 9、离心管 10、去离子蒸馏水 试剂贮存 1、试剂盒贮存在2～8℃，切勿冰冻 2、未用完的微孔板反应该密封干燥2～8℃保存 注意事项 1、终止液具有刺激性，显色剂具有毒性，切勿接触皮肤 2、试剂盒过期后不得使用 3、请勿混用不同批号的试剂 工作溶液准备 1、酶标物工作液：使用时精确加入12mL酶标物溶解液充分溶解，使用前恢复至室温，并且摇匀，切勿涡旋振荡。 2、样品稀释液工作液：使用时加入40ml双蒸水充分溶解后使用。 3、清洗液：用蒸馏水1:10稀释（1＋9）。注意：如有结晶请在室温下摇动彻底溶解 4、显色剂：已备用，请避免光线直照 5、终止液：已备用 6、黄曲霉毒素M1标准品：已备用 9、 样品处理 一、牛奶 1、样品冷藏，2～8℃下3000g离心10分钟 2、分离奶脂和奶清 3、奶清直接检测（稀释倍数：1倍） 二、奶粉 1、称取奶粉1g加10ml蒸馏水 2、振荡使奶粉彻底溶化后取50ul用于检测 3、稀释倍数：10 三、奶酪 1、不要另加液体捣碎样本 2、称取2g碎奶酪放入带盖试管 3、加入15ml二氯甲烷振摇抽提30分钟 4、过滤上清液 5、转移3.75ml抽提液到另一试管，60℃下氮气吹干 6、用750ul样品稀释液重新溶解并涡旋混匀1分钟 7、加入750ul正己烷，涡旋抽提1分钟 8、2000g离心15分钟 9、移去上层正己烷 10、取50ul甲醇/ acqueous相，用200ul样品稀释液在小试管中稀释后混匀取50ul用于检测 稀释倍数：2 10、 检测步骤 一、实验须知 1、使用前用2小时左右时间让试剂恢复到室温 2、用后立即将试剂放回2～8℃ 3、不要改变分析步骤，尤其： 微孔板在20～25℃下恢复到室温 务必使用精确的微量进样器和枪头 一旦开始就不要中断所有步骤 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于洗板操作，请严格按照要求操作 4、为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的枪头加样 5、加样时请勿让枪头接触微孔中的溶液或内表面 二、分析步骤 1、做好记录，标记B0，标准和样本的位置，请确保重复双孔检测 2、从反应板上取出所需要的数量微孔，将多余的重新放回2～8℃保存 3、将酶标物（冻干粉）、清洗液（10X）配制成工作液 在B0孔中加入50μL已稀释的样品稀释液 在各标准孔中加入50μL的标准品溶液 在各样品孔中加入50μL样品溶液 4、所有微孔加100ul酶标物工作液（强烈要求使用多道移液器） 5、轻轻晃动反应板几秒钟 6、室温（20－25℃）温浴10分钟，温浴期间振荡混匀3－4次 三、清洗步骤 倾倒微孔中的液体 在所有微孔中加满洗涤液（250～300μL） 重复上述两步骤3遍以上 在吸水纸上拍打，彻底清除微孔中的残留液和气泡（拍打后未