HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测.pdfVIP

中国医药生物技术2008年6月第3卷第3期 ChinMedBiowdmol，June2008．V01．3，No．3 ·论著· HCV非结构蛋白质5A基因全长 和高免疫源区的表达及免疫活性检测 余龙林，杨芳，朱娟莉，陈超 【摘要】 白的高免疫源区(基因型用NS5AS代替)位于 目的 探讨HCV非结构蛋白质5A(NS5A)基因全长和 高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。 活性较强的区域，具有很好的HCV检测特异性。 方法 以含HCV全基因组的质粒pBR“，HCV-3011(1b 型)为模板，采用PCR方法扩增出NS5A全长基因(以 抗原在HCV检测中的灵敏度，为将来更好地应用 下用NS5AL代替)和高免疫源区基因(以下用NS5AS代 于HCV感染的临床检测奠定基础。 替)，与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pET- Rosetta(DE3) NS5AL和pET-NS5AS，分别转化E．coli pLysS和BL21(DE3)感受态细胞，经异丙基一B-D．硫代 1材料与方法 半乳糖苷(IFIG)诱导后，蛋白质印迹法检测其表达，镍 1．1 主要材料 螯合(Ni2+-NTA)琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和 1．1．1 标本 5例1b型HCV阳性和1例 NS5AS蛋白，最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活 HCV阴性血清均由国家微检测工程技术研究中心 性并对其检测灵敏度进行比较。 基因分离实验室保存。 结果 SDS．PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明，重组1．1．2主要试剂和仪器含有HCV全基因组的 NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达；纯化的重组 NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0．146和0．426m∥rnl， 杜德伟博士惠赠；E．coli 纯度均96％；ELISA检测结果表明，重组NS5AL和 西北农林科技大学生命科学学院生物化学教研室 NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性，且重组NS5AL蛋白 徐虹老师惠赠；E．coli 的检测灵敏度明显高于NS5AS。 国家微检测工程技术研究中心基因分离实验室保 结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白，均具有 MasterMix 较高的免疫活性，将有助于提高HCV临床检测的灵敏度。 性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连 【关键词】肝炎病毒； 病毒非结构蛋白质类； 基因 接酶均购自日本TaKaRa公司；辣根过氧化物酶标 表达： 免疫活性 物技术有限责任公司；抗His6mAb购自上海生工 www．cmbp．net．cn 串雹医药生物技术．2008,3(3)：177-182 生物工程技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒抽提 试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；DAB显 HCV为单股正链RNA病毒，分类属于黄病 色试剂盒购自河南洛阳华美生物工程公司；异丙 毒属ll。2】。目前，用于诊断HCV感染的方法有血清