pCDNA3.1NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达.pdfVIP

UniversitatisMedicinalisAnhui2010 ·621· 安徽医科大学学报Acta Oct；45(5) 系HepG2中稳定高表达 徐珩L2，杨硕2，顾娜2，冯丹丹2，间军2，汪思应1 摘要 目的 建立癌一睾丸抗原NY—ESO．1稳定表达的 HepG2肝癌细胞系。方法设计NY—ESO-1的引物．PCR法 TCR基因转导淋巴细胞过继性免疫治疗肝癌的研 从NY—ESO一1阳性表达的睾丸癌组织中扩增出目的片段，克 隆至T载体，双酶切后定向连入pCDNA3．1载体，构建pCD． 外攻击实验的靶标。而肝癌细胞系HepG2虽为 NA3．1／NY．ESO．1真核表达质粒。经酶切、PCR、测序检测其 HLA—A2限制性，但并不表达NY—ESO．1抗原。因此 构建的正确性，脂质体转染法将重组质粒转入HepG2细胞， 笔者构建了重组真核表达质粒pCDNA3．1／NY—ESO． G418药物筛选出稳定转染的细胞系，RT-PCR法、间接免疫 1，用脂质体转染的方法将该质粒转入肝癌细胞系 荧光法分别检测稳定转染HepG2细胞中NY—ESO．1基因、蛋 白的表达水平。结果 构建的pCDNA3．I／NY．ESO．1质粒 经酶切、测序等检验表明质粒构建成功，筛选获得稳定高表 表达的肝癌细胞系。 达NY-ESO-1的HepG2细胞。结论构建了pCDNA3．1／ 1材料与方法 NY—ESO一1真核表达质粒及稳定高表达NY-ESO-l的HepG2 细胞株，为下一步以NY—ESO—l为靶标进行肝癌的抗原特异1．1仪器和试剂 性免疫治疗研究奠定了实验基础。 主题词癌，肝细胞；转染；免疫疗法；荧光免疫测定 自由词NY-ESO-1；HepG2细胞；真核表达质粒 735．7 中图分类号R394．33；R rad)等。 文献标识码A文章编号1000—1492(2010)05—0621—05 1．1．2 NY—ESO—l(NewYork cell DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、pMDl8．T esophagealsquamous 载体(TaKaRa)，玻璃奶型凝胶回收试剂盒(威格拉 carcinoma 1)是一类特异性强的肿瘤抗原，同时也是 目前免疫原性最强的肿瘤抗原之一。在抗肿瘤免疫 中，细胞毒T细胞(CTL)起着极其重要的作用。有 研究表明，外周血单个核细胞(PBMC)经白细胞介 ESO一1单克隆抗体(E978，c-53869，SantaCruz)，羊 素-2(IL-2)诱导后可增强对肿瘤细胞的杀伤效 抗小鼠IgG-FITC(北京中杉金桥)，RPMI1640(北京 应…，而CTL表面的T细胞受体(TCR)可以直接特 异地识别肿瘤细胞表面HLA分子呈递的抗原肽，攻 EDTA(Gibco)，G418(北京天佑达)。 击和破坏肿瘤细胞。因此基于肿瘤抗原特异性细胞 1．1．3细胞HepG2肝癌细胞系由北京佑安医院 毒T淋巴细胞的免疫治疗，被认为是一种颇具发展 肝炎所娄金丽教授馈赠。 前景的治疗策略【2J。本课题拟以NY．ESO．1为靶