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限制性内切酶酶切常见问题分析 限制性内切酶酶切常见问题分析 限制性内切酶酶切常见问题分析 限制性内切酶酶切常见问题分析 限制性内切酶酶切常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 DNA电泳常见问题分析 成都医学院-生化与分子生物实验 * 实验十 限制性酶切与连接 一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA,并能进行自我复制的DNA 分子称为Vectors 主要载体:质粒、噬菌体、病毒 功能:克隆载体(构建基因组文库或cDNA 文库)、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入,不断出现具有不同功能的新载体,如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体 载体(Vectors) 如何构建所需要的载体? 酶切 连接等技术 一、DNA的限制性酶切实验原理 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,功能犹似高等功物免疫系统, 用于抗击外来DNA侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH。 根据限制酶的识别切割特性, 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序,在识别位点很远的地方任意切割DNA链,切割核苷酸顺序没有专一性,随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类(III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。 1. 限制性内切酶的类型 第二类(Ⅱ型)限制性内切酶就是通常指的DNA限制性内切酶. 它们能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行切割,产生特异的DNA片段; Ⅱ型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序; Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端突出、3’端突出和平末端。 限制性的内切酶的发现和应用, 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 1. 限制性内切酶的类型 粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为: 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是: 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。 平头末端: 限制性内切酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP Ⅰ类 三亚基双功能酶 二分非对称 至少在识别位点外 1000bp Yes Ⅱ类 内切酶与甲基化酶分子不在一起 4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 No Ⅲ类 二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp Yes 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称,如E. coli 用Eco表示,所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d,即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰酶,则以罗马数字表示,如HindⅠ, HindⅡ,HindⅢ等。 2. 限制性核酸内切酶的命名法 由 pUC18改造而来,大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。 1.内切酶: 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染; 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端; 内切酶的用量:根据内切酶单位和DNA用量而定,通常
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