RNA提取准备工作及注意事项.doc

一、枪头和EP管等的消毒灭菌 1、用去离子水配制0.1%的DEPC剧毒物，须在通风橱中小心使用，避光; DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。经检测不含 RNase、DNase和proteinase。 2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP避光、静置、过夜4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好 5、121摄氏度，30min 6、180摄氏度，干燥数个钟头（）注意：处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！ 4、样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素 样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。 5、裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素 常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。 6、纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素 对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。 7、RNA 抽提的“三大纪律八项注意” 纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。 纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。 8、RNase 污染的10大来源 1）手指头，手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。 2）枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。 3）水/缓冲液一定要确保无 Rnase 污染。 4）实验台面最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。 5）内源 Rnase所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。 6）RNA 样品RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。 7）质粒抽提质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。 8）RNA 保存即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。 9）阳离子 （Ca， Mg）在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。 10）后续实验所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。 9、RNA 抽提的10大窍门 1：快速阻止 Rnase 活性样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。 2：选择合适的抽提方法高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。 3：预判质量要求Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 对完整性要求不