实验二十赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶.docVIP

实验二十 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 ? 【原理】 利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，．求出样品中 ALT 活性。 【试剂】 1. 0.lmol ／ L 磷酸二氢钾溶液称取 KH 2 P0 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至 1 000ml ， 4 ℃保存。 2. 0.lmol ／ L 磷酸氢二钠溶液 称取 Na 2 HP0 4 14.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至 1 000ml ， 4 ℃保存。 3. 0.lmol ／ L 磷酸盐缓冲液 (pH7.4) 取 420ml 0.1mol ／ L 磷酸氨二钠溶液和 80ml0.lmol ／ L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为 pH7．4 的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴， 4 ℃保存。 4. 基质缓冲液 精确称取 D-L- 丙氨酸 1．79g ， α - 酮戊二酸 29.2mg ，先溶于 0.lmol ／ L 磷酸盐缓冲液约 50ml 中，用 lmol ／ L NaOH 调 pH 至 7．4 ，再加磷酸盐缓冲液至 lOOml ， 4 ～ 6 ℃保存，该溶液可稳定 2 周。每升底物缓冲液中可加入麝香草酚 0.9g 或加氯仿防腐， 4 ℃保存。配成 200mmol ／ L 丙氨酸与 2.0mmol ／ L α - 酮戊二酸基质缓冲液。 5. 1.0mmol ／ L 2,4- 硝基苯肼溶液 称取 2,4- 二硝基苯肼 (AR)19.8mg ，溶于 l.0mol ／ L 盐酸 100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若有结晶析出，应重新配制。 6. 0.4mol ／ L NaOH 溶液 称取 NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至 100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 7. 2.0mmnol ／ L 丙酮酸标准液准确 称取丙酮酸钠 (AR)22 ． 0mg ，置于 100ml 容量瓶中，加 0.05mo1 ／ L 硫酸至刻度。丙酮酸不稳定；开封后易变质 ( 聚合 ) ，相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。 8 ．待测标本病人血清或质控血清。 【操作步骤】 1 ． ALT 校正曲线绘制 (1) 按表 14-7 向各管加入相应试剂。 (2) 混匀，放置 5min ，在波长 505nm 处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“ O ”号管吸光度为该标准管的吸光度值。 (3) 以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成校正曲线。 2 ．标本的测定 (1) 在测定前取适量的底物溶液和待测血清， 37 ℃水浴预温 5min 后使用；具体操作按表 14-8 进行。 (2) 室温放置 5min ，在波长 505nm 处以蒸馏水调零，读取各管吸光度。 【计算】 测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在校正曲线上查得 ALT 的卡门单位。 【参考范围】 5 ～ 25 卡门单位。 【临床意义】 ALT 在肝细胞中含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。当肝受损时，此酶可释放入血，致血中该酶活性浓度增加，故测定 ALT 常作为判断指标。 1 ．肝细胞损伤的灵敏指标急性病毒性肝炎转氨酶阳性率为 80 ％～ 100 ％，肝炎恢复期，转氨酶转入正常，但如在 100U 左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎；重症肝炎或亚急性肝坏死时，再度上升的转氨酶在症状恶化的同时，酶活性反而降低，是肝细胞坏死后增生不良，预后不佳。以上说明，监测转氨酶可以观察病情的发展，并作预后判断。 2 ．慢性活动性肝炎或脂肪肝转氨酶轻度增高 (100 ～ 200U) ，或属正常范围，且 ASTALT 。肝硬化、肝癌时， ALT 有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。其他原因引起的肝损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使 ALT 、 AST 明显升高；某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起 ALT 的升高。 3 ．但其他疾病或因素亦会引起 ALT 不同程度的增高，如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。 【注意事项】 1 ．丙酮酸标准液的配制丙酮酸不稳定，见空气易发生聚合反应，生成多聚丙酮酸，而失去其化学性质。在配制校正曲线时，不会出现显色反应。此时应将变性的丙酮酸放在干燥箱 (40 ～ 55 ℃ )2 ～ 3h ，或干燥器中过夜后在使用。 2 ．基质液中的 α - 酮戊二酸和显色剂 2,4- 二硝基苯肼均为呈色物质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过 0.015A ，如超出此范围，应检查试剂及仪器等方面问题。 3 ．血清中 ALT