气相色谱层析技术原理基本部件以及条件选择.docVIP

气相色谱层析技术原理、基本部件以及条件选择 (一)基本原理混合样品的气流通过固定相时，根据各组分对固定相的吸附强弱不同使不同成分得到分离。利用气相色谱层析技术做为微生物诊断的工具已成功地用于微生物的分类和鉴定。该法敏感性强，能够分离和检测到毫微克的水平。它具有快速的特点，常在数十分钟甚至数小时就可以对传染病做出早期诊断。其结果稳定，重复性好，但不足之处是操作中各因素不易控制，方法不易标化等。(二)气相色谱仪的基本部件1. 载气 常用的载气主要有氮、氩、氢和二氧化碳等。这些气体一般都由高压气瓶供给。2. 进样器 气相色谱仪可以用于分离固相、气相和液相标本。液相标本采用微升注射器穿过橡皮隔片注入，气相标本采用特种气相注射器注入。3. 谱柱及加热炉 色谱柱一般由金属或玻璃制成，通常采用的柱长2m~4m，内径2mm, 毛细管柱长度可达20m～150m，内径为0.2mm。载体一般采用惰性、多孔的固体颗粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同极性的微生物化合物，为了获得最适的分离条件，要求有不同固定相的载体。目前比较常 用的载体有：聚乙二醇(CarbOwax 20M)、F F A P(聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应产物)，OV—17(苯基甲基硅酮)。OV-210、SE-30(甲基硅酮)、Chromosorb G(白色硅藻土载体)等。柱加热炉在温度控制上是非常重要的。4. 纪录仪5. 数据处理装置 一般均附有数据处理计算机。气相色谱仪的基本流程图如下图1-1： ? 进 样 器 ? 计 算 机 ? ? 载气源 ? 阀门 ? 气化室 ? 色谱柱 ? 检测器 ? 纪录仪 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 图1 气相色谱仪的基本流程 (三)试验条件的选择1. 色谱柱的选择 要注意极性及最高使用温度，柱温不能超过最高使用温度。固定相按极性相似的原则选择。色谱柱的内径大小、长度都能影响分离率。一般而言，内径越小，长度越长，分离效果越好，一般柱长为1m～5m(毛细管柱则20m～100m)。填充剂颗粒一般采用40目～60目，60目～80目及80目～100目大小。长柱子宜用粒度大些的，以减少柱压降，短柱子则用粒度细的。气相色谱中固定液的含量对分离效率的影响较大。一般采用固定液与载体重量之比为15︰100～25︰100。采用高灵敏度的检测器，由于进样量减少，固定液含量可以降至5︰100以下。这样可以使用较低柱温，从而提高柱效，缩短分析时间。但固定液用量太少会引起吸附。2.柱温选择 柱温选择对分离度影响很大，常是条件选择的关键。选择的基本原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离高度的前提下，尽可能采取较低温度，但以保留时间适宜及不拖尾为度。⑴ 高沸点混合物(200℃～400℃)，若需在较低的柱温下分析，可采用低固定液配比1%～3%，采用高灵敏检测器，柱温可比沸点低100℃～150℃，在200℃～250℃的柱温下分析。⑵ 沸点300℃的样品，可用3%～25%固定液配比。沸点越低，所用配比越高，柱温可比平均沸点低50℃至平均沸点的范围选择。3.载体选择 载体采用低线速时，宜用氮气;高线速时用氢气。柱越长，柱内有较大压力降，宜用氢气。载气采用低线速时为20ml～80ml/min。4.其它条件⑴ 气化室温度及检测室温度选择：气化温度取决于样品的挥发性、沸点、稳定性以及进样量，一般选择稍高于样品沸点，但不要超过沸点50%以上，以防分解。检测室温度需高于柱温，一般高于柱温30℃左右或与气化室同温。⑵ 进样量：固定相在配比15%～35%的层析柱时，最大进样量液体为10μl，气体为10ml。一般样品量液体4μl，气体为0.5ml～3ml，固体小于1mg。⑶ 桥电位选择：散热多和选择大的桥电位，在灵敏度相同的情况下，应尽量选择低桥电位，以保护热敏元件。(四)填充柱的制备1.称取一定量的载体于蒸发皿中，加2倍于载体体积的低沸点溶剂(氯仿丙酮、三氯甲烷等)，使之溶解。2.取适量的固定液，倒入蒸发皿中，拌匀。注意应使载体全部覆盖在液面下，于红外灯下缓缓加热，不时轻轻搅拌，待溶液全部挥发。3.先将柱的一端用玻璃毛轻轻堵上，接上吸滤真空泵，柱的另一端接上漏斗，将填充剂从漏斗加入，同时启动真空泵，不时轻敲柱子各部，以使填充均匀。装满后，关闭真空泵，取下色谱柱，将加样的一端也填上一小团玻璃毛。4.将柱装入色谱柱中，在通载气前，先将炉温升至略高于操作温度，保持约1h，以使固定液受热熔化或粘度减小，在载体表面流布均匀，然后再通入载气，使色谱柱在操作温度下，通载气数小时。(五)样品处理以细菌培养物样品的处理为例。1.取3～5个菌落，接种于2ml含有3%葡萄糖TSB肉汤(即含胰酶1