古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α—淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

维普资讯 奄 鬻 维普资讯 第 29卷 第 3期 沈 微等 ：古细菌Pyrococcus 引物为 ： 引物 A：5’一ACCGGAATTCATGAA— CATAAAGAAAT一3’ 引 物 B：5’一CAAGGAATTCATG— GCAAAATACTTGGAGC一3’ 引 物 C：5’ 一 AATTGTCGACAG— TATTTGCACTTCTCC一3’ 其 中，引物A与P．furiosusa一淀粉酶含 信号肽结构基因5’端互补，原基因起始密码 子为 GTG是大肠杆菌稀有密码子，引物 中 改成常用的ATG。引物B与成熟肽结构基 因5’端互补，并增加 了ATG。引物 A、B的 5’端均增加了EcoR I切点。引物 C与结构 基因下游的序列互补，并含 SalI切点。 1．3 PCR扩增 PCR的反应条件为 ：94℃变性 10min， 加入 PyrobestMDNA聚合酶 1．5个单位，混 合后加入矿物油 30 L进行 PCR反应(94oC 60s，58℃ 60s，72℃ 120s)，经过 30个循环 后，在 72℃延伸 10min。 1．4 DNA重组、转化及阳性转