家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达.pdfVIP

维普资讯 第 4l卷 第5期 河 南 农 业 大 学 学 报 V01．4l No．5 2007正 l0月 JournalofHenanAgriculturalUniversity 0ct． 2007 文章编号 ：1000—2340(2007)05—0545—05 家蚕核型多角体病毒 ORF75基因的克隆及表达 尹新明，安世恒，江志伟，胡 鹏 (河南农业大学植物保护学院，河南 郑州450002) 摘要 ：根据 GenBank发表的序列(L33180)设计引物，利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒 (Bombyx moriNucleopolyhedrovirus，BmNPV)ORF75基 因的DNA片段 ，将其连接至 pMD18一T栽体上 ，获得 了该基 因成熟 蛋 白阅读框序列．利用设计的酶切位点将 目的基 因从克隆载体上切下．表达质粒 pGEX-4T一2经BamHI／XhoI双 酶切，与 目的片断连接，得到重组表达质粒 pGEX／Bm75．将重组表达质粒 pGEX／Bm75转化入 大肠杆茵BL21 中，经 IPTG诱导表达后，12％ SDS．PAGE分析表明产生57kDa左右的特异蛋 白质条带．对表达产物进行Western blotting分析，结果表明，pGEX／Bm75经 IPTG诱导产生的57kDa蛋 白条带与抗体发生了很强的交叉反应，融合 蛋 白得到了表达． 关键词：家蚕；核型多角体病毒；ORF75基因；克隆；表达 ． 中图分类号 ：Q78 文献标识码 ：A CloningandExpressingofORF 75geneofBombyx morinucleopolyhedrovirus YINXin—ming，AN Shi—heng，JIANGZhi-we，HU Peng (CollegeofPlantProtection，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China) Abstract：basedonprimersdesignedaccordingtosequence(L33180)publishedonGenBankand Bombyxmorinucleopolyhedrovirus(BmNPV)，DNAfragmentofBmNPVORF75genewasobtained usingPCR amplificationandwasclonedintopMD18-Tvector．Thematureproteinopenreadingframe oftheDNA wasobtained．ThefragmentwasdigestedbytworestrictionenzymeBamHI／XhoI，andwas 。 joinedwithpGEX-4T-2plasmidwhichwasdigestedbyBamHI／XhoI．ThepGEX／Bm 75wasob- tained，andpGEX／Bm 75wastransformedintoBL21．ByinducingwithIPTG，theGST-Bm 75fusion proteinwascheckedby12％ SDS(SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis)andWesternblo- ting．Theresultshowedthatthemolecularweightoffusionproteinwasabout57kDawithaGSTtag， andthefusionprote