全长cDNA文库的构建—SMART技术.pdfVIP

中国试剂网 3.9.206 全长cDNA 文库的构建—SMART 技术 真核细胞的mRNA 在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽” 的过程，因此mRNA 的3末端都带有一段Poly A ，这是利用逆转录酶制备cDNA 文库的基础。但是由 于 cDNA 的 5端的序列各不相同，如何获得全长的 cDNA，如何扩增由微量的 mRNA 逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA （即 RACE ），曾经是一个令人困扰的问题。 常见的做法是在合成 cDNA 的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列 再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA 的3末端加上一连串的G 或 者 C （或者A/T ），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但是这 些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信 息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复 的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上 会影响结果的准确性。另外由于mRNA 容易部分降解，很难确定得到的cDNA 是否就是全长的cDNA ，还是cDNA 的片断。 SMART 技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA 的反应 中事先加入的3末端带Oligo （dG ）的SMART 引物，由于逆转录酶以mRNA 为 模板合成cDNA，在到达mRNA 的5末端时碰到真核mRNA 特有的“帽子结构”， 即甲基化的G 时会连续在合成的cDNA 末端加上几个（dC ），SMART 引物的Oligo （dG ）与合成cDNA 末端突出的几个C 配对后形成cDNA 的延伸模板，逆转录 酶会自动转换模板，以SMART 引物作为延伸模板继续延伸cDNA 单链直到引物 的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo （dT ）的起始引物序列， 另一端有已知的SMART 引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。 由于有5帽子结构的mRNA 才能利用这个反应得到能扩增的 cDNA ，因此扩增 得到的cDNA 就是全长cDNA 。 这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即 可完成，不需要额外的 cDNA 抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要 少至25ng 的mRNA 或者50ng 的Total RNA 就可以得到高质量、高产量的cDNA 库，更重要的是得到的cDNA 能够代表原有样品中的mRNA 的丰度，可以应用 中国试剂网 3.9.206 于直接扩增基因、构建 cDNA 文库、已知序列钓全长 cDNA （RACE ），和用于 芯片检测的cDNA 探针的扩增等。 我们在这里分别介绍几个采用SMART 技术的产品： 一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit 这个试剂盒是采用SMART 技术将少至25ng 的mRNA 或者50ng 的Total RNA 制备成可大量扩增的cDNA，提供包括SMART 引物、CDS 引物、PCR 引物、合 成第一链Buffer 、dNTP 、DTT 、Advantage PCR Kit(15rxns)和纯化cDNA 用的纯 化柱和对照RNA 在内的试剂。其中CDS 引物是含有经过修饰的Oligo （dT ）的 起始引物，能特异结合在mRNA 加Poly A