一种不配对粘末端连接的新策略.pdfVIP

军事医学科学院院刊 年 月 第 卷 第 期 200l 3 25 l BuII Acad MiI Med Sci，Mar 200l； VOI 25 NO l 75 一种不配对粘末端连接的新策略 刘永全，高杰英，孔祥英 （军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京 l00850 ） 整合素是粘附分子的一个家族，是由 和 亚 条带（图 ），与设计相符，证明 重组质粒构 U B 2 p3X-7Z 基通过非共价键连接而形成的一类异二聚体，目前 建成功。 ［］ 已发现 l 20 多种 。4 7 就是其中一种，它的主要功 UB 能是通过与配体粘膜地址素细胞粘附分子 （ -l mucOs- ， ）的相 aI addressin ceII adhesiOn mOIecuIe-l MAdCAM-l 互作用而介导淋巴细胞在粘膜部位的归巢和定居， 并参与该部位的免疫应答。抗 的单抗（ ）可 7 mAb B 有效阻断 4 7 介导的多种功能，已成功用于多种研 UB 究。我们将编码 7 亚基主要抗原表位的 l. 8 kb B ［］ 2 cDNA片段 ，亚克隆入原核融合表达载体 pGEX- ，以期获取 的原核表达产物、制备抗体及进行 3X 7 B 相应功能研究。由于载体与外源片段之间无合适的 酶切位点，因此首先利用Bam H / Eco R 位点，连 I I 接表达载体pGEX-3X 和克隆载体pGEM-7Z，从而得 以在pGEX-3X 中引入Sph 位点，再利用Bam H / I I Sph 位点，完成目的片段的亚克隆。该过程通过 I 载体之间的连接，引入合适的酶切位点，巧妙地变不 配对粘末端的连接为配对粘末端的连接，高效快速 地完成了目的片段的亚克隆，不失为一种解决不配 图 重组质粒 的构建示意图 1 p3X-1. 8 7 ! 对粘末端连接的新策略，可为类似研究提供借鉴。 1 材料与方法 1 . 1 菌株和质粒 大肠杆菌JMl09、原核融合表达载体pGEX-3X、 克隆载体pGEM-7Z，由本室保存。质粒pBS- 7（带有 B ［］ 3 7 的全长cDNA ），由David J . ErIe 博士惠赠 。 B 1 .2 限制性内切酶及连接酶 限制性内切酶 ， ， 购自 Eco R I BamH I Sph I 华美公司， 连接酶购自大连六和通公司。 T4 DNA 1 . 3 p3X-1 . 8 7 重组质粒的构建 ! 首先，分别对表达载体 pGEX-3X 和克隆载体 pGEM-7Z 进行 Bam H / Eco R 双酶切，再将二者 I I 连接，构建成重组质粒 p3X-7Z